RNA Seq, qRT-PCR, Western blot и иммуногистохимия были выполнены в доступном миокарде LV от пациентов с CMP (n = 35) для выявления экспрессии мРНК и белков целевых генов у пациентов, несущих регуляторные варианты в BRAF, DSP, FKTN, LARGE1 , ПРКАГ2 или ТГФБ3 . Для данных секвенирования РНК, целевую масштабированную экспрессию гена RPKM сравнивали между пациентом, у которого был вариант (красная точка), и остальной частью когорты (черные точки) с использованием прямоугольных диаграмм, показывающих медианную экспрессию для когорты, 25 ^th и 75 ^th процентилей, а также максимальные и минимальные значения (n = 35).Для кОТ-ПЦР, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии экспрессия целевого гена или белка в миокарде ЛЖ пациента, несущего этот вариант, сравнивалась с контролем дикого типа, включая образец аутопсии от человека без сердечного заболевания, а также один или несколько CMP пациенты, которые не имели каких-либо известных патогенных кодов или вариантов регуляции. Для каждого образца было проведено три независимых эксперимента, каждый из которых включал три технических повтора для каждого образца. Уровень экспрессии белка GAPDH в качестве гена домашнего хозяйства использовали в качестве контроля загрузки для вестерн-блоттинга.Планки погрешностей указывают стандартное отклонение между средними значениями каждого независимого эксперимента. ( a ) BRAF : вариант промотора chr7: 140624223_G / A был связан с нормальной экспрессией мРНК BRAF на RNAseq, но снижал экспрессию мРНК BRAF при qRT-PCR. Вариант промотора chr7: 140624286_C / T был связан с повышенной экспрессией мРНК на RNAseq (> 75 ^th процентиль). ( b ) DSP : вариант промотора (chr6: 7541776_G / A) был связан с повышенной экспрессией мРНК DSP на RNAseq (> 75 ^th процентиль) и на qRT-PCR (* p <0.05 по сравнению с элементами управления). ( c ) FKTN : вариант промотора 1 (chr9: 108320330_G / A) был связан со сниженной экспрессией мРНК FKTN на RNAseq (<75 ^th процентиль), сниженной экспрессией мРНК на qRT-PCR (p <0,05 по сравнению с контролями), снижение экспрессии белка на репрезентативных изображениях вестерн-блоттинга и снижение относительного содержания белка при количественной оценке (* p <0,05 по сравнению с контролями). ( d ) LARGE1 : Вариант промотора chr22: 34316416_C / T был связан с более низким перинуклеарным окрашиванием LARGE1 (коричневый) (ядерное окрашивание, синий) на репрезентативных иммуногистохимических изображениях и более низким% LARGE1-положительных клеток в миокарде пациента (* р <0.05 по сравнению с элементами управления). Ткань тимуса использовалась в качестве отрицательного контроля. Шкала шкалы = 20 мкм. ( e ) PRKAG2 : вариант энхансера chr7: 1513

RNA Seq, секвенирование РНК; WT, дикого типа

Влияние регуляторных вариантов на транскрипцию гена с использованием репортерных анализов

Репортерный анализ люциферазы

Генные промоторы или энхансер + промоторы, несущие кандидатные SNV и соответствующую контрольную область, клонировали в репортеры люциферазы светлячка и трансфицировали в индуцированный человеком плюрипотент Кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (ИПСК), для определения влияния вариантов на транскрипционную активность репортерного гена люциферазы (, дополнительная фигура 4a, ).Клонированные варианты промотора BRAF (chr7: 140624223_G / A), DTNA (chr18: 32072866_A / G), FKRP (chr19: 47249754_C / T), FKTN_A 3, chr9r9: 108320330_G / A) и LARGE1 (chr22: 34316416_C / T) снижали активность люциферазы по сравнению с контрольными последовательностями. Вариант промотора DSP ( chr6: 7541776_G / A ) , второй вариант промотора LARGE1 ( chr22: 34316687_G / A ) и вариант энхансера TGFB3 (chr14 / G14: 7628) значительно повышенная активность люциферазы по сравнению с контрольными последовательностями (, фиг. 7a, ).Измененная регуляция транскрипции репортера люциферазы путем встраивания вариантов промотора и энхансера нескольких генов CMP предполагает прямой регуляторный эффект этих SNP на транскрипцию целевого гена.

( a ) Репортерный анализ люциферазы, показывающий влияние регуляторных вариантов на транскрипцию. Клонированные варианты промотора BRAF (chr7: 140624223_G / A), DTNA (chr18: 32072866_A / G), FKRP (chr19: 47249754_C / T), FKTN_A 3, chr9r9: 108320330_G / A) и LARGE1 (chr22: 34316416_C / T) снижали активность люциферазы по сравнению с контрольными последовательностями.Вариант промотора DSP ( chr6: 7541776_G / A ) , второй вариант промотора LARGE1 ( chr22: 34316687_G / A ) и вариант энхансера TGFB3 (chr14 / G14: 7628) значительно повышенная активность люциферазы по сравнению с контрольными последовательностями. * p <0,05 по сравнению с контрольной последовательностью. Все анализы люциферазного репортера проводили с 3 биологическими повторами, каждый с 3 техническими повторами. ( b ) График вулкана, представляющий влияние 54 регуляторных вариантов на экспрессию генов с использованием MPRA.29 вариантов имели значительные различия в транскрипционной активности между референсным и альтернативным аллелями (FDR <0,05, представлен горизонтальной черной линией). Серый = активность варианта CMP ниже, чем у референсного аллеля; черный = активность варианта CMP выше, чем референсный аллель. ( c ) 66% значимых вариантов были связаны с более высокой транскрипционной активностью референсного аллеля. ( d ) Log2-кратные изменения транскрипционной активности между альтернативными и референсными аллельными последовательностями.( e ) Репрезентативные графики подсчета MPRA альтернативного аллеля (зеленый) по сравнению с последовательностями референсных аллелей (серый) BRAF (chr7: 140624223_G / A), DSP (chr6: 7541468_T / C) и DTNA (chr18: 32073296_C / G). Все анализы MPRA проводили в 5 независимых биологических повторностях.

MPRA, массово-параллельный репортерный анализ; ref seq, эталонная аллельная последовательность; FDR, ложное обнаружение; CMP, кардиомиопатия

Массивно-параллельный репортерный анализ (MPRA)

Для оценки функционального эффекта дополнительных регуляторных вариантов уровня 1 на транскрипционную активность мы использовали MPRA с более высокой пропускной способностью в кардиомиоцитах ^22,23 .В частности, мы протестировали регуляторные эффекты 54 вариантов путем анализа транскрипционной активности их референсных и альтернативных аллелей (каждый аллель представлен 25 уникальными штрих-кодами, см. Методы) в iPSC-кардиомиоцитах PGP17 (n = 5 независимых повторов) ( Дополнительный рисунок 4b). -e, Дополнительная таблица 8 ). Из 54 исследованных вариантов 29 вариантов (54%) показали значительные транскрипционные различия между двумя аллелями [коэффициент ложного обнаружения (FDR) <0,05] ( рис. 7b , c ) с изменением в 2 раза в диапазоне от -2.72 до +2,23 ( Рисунок 7d, Дополнительная таблица 8 ). Это представляло 26 дополнительных вариантов с высокой регуляторной активностью помимо тех, которые были подтверждены в предыдущих анализах репортера миокарда и люциферазы. Репрезентативные примеры подсчета MPRA показывают высокую регуляторную активность вариантов в локусах BRAF, DSP и DTNA ( Рисунок 7e ). В целом, результаты MPRA подтверждают, что наша WGS уверенно идентифицировала варианты, которые функционально активны в кардиомиоцитах.

Таким образом, наши результаты с использованием WGS выявили значительный вклад регуляторных вариантов и CNV в генах CMP (в 20% случаев) и небольшой, но заметный вклад вариантов, кодирующих белок LoF в новых генах (еще в 5% случаев). случаев) с началом CMP в детстве.

ОБСУЖДЕНИЕ

WGS дает большое количество вариантов, кодирующих и регулирующих белок зародышевой линии. Пониманию их вклада в болезнь человека мешает отсутствие строгих биоинформатических и функциональных подходов, адаптированных к изучаемому заболеванию.Используя WGS в CMP, мы выявили вредоносные варианты кодирования белков у 36% нашей когорты, включая 7,5%, которые были пропущены, несмотря на клинические испытания генов-кандидатов. Более того, мы обнаружили 5% пациентов с вредными вариантами в новых генах CMP и, что очень важно, еще у 20% пациентов с регуляторными вариантами высокого риска, о которых ранее не сообщалось в CMP. Было подтверждено, что важное подмножество этих регуляторных вариантов влияет на экспрессию экзогенных и эндогенных генов в функциональных анализах, тем самым обеспечивая убедительные доказательства их вклада в CMP.Обнаружение и проверка этих новых вариантов снизили вдвое количество неуловимых генов случаев БКМ в нашей когорте.

Из новых генов, содержащих вредоносные варианты кодирования белков, два гена, NRAP и FHOD3 , оказались сильными кандидатами. Оба важны для поддержания саркомерного и актинового цитоскелета в сердце и были связаны с CMP в исследованиях на мышах и небольших сериях случаев ^{36–43,59,60} . Наш пробанд был гомозиготным по варианту LoF в NRAP , как и ранее описанная семья с аутосомно-рецессивным фенотипом DCM ³⁹ .Более того, в нашей репликационной когорте также было обнаружено большое количество вариантов этих генов. Сниженная экспрессия NRAP в миокарде пациента в сочетании с данными о сниженной экспрессии nrap и fhod3 и фенотипом CMP у рыбок данио подтверждают доказательства того, что NRAP и FHOD3 являются новыми генами, которые следует рассматривать как сильные гены-кандидаты для клинических испытаний при ХМП.

Чрезвычайно захватывающим открытием нашего исследования было обогащение высокоэффективных регуляторных SNV и CNV в случаях по сравнению с контролем, при этом 20% случаев несли эти варианты в рекуррентно мутировавших областях, активных в LV человека.При анализе по подтипу CMP, выход регуляторных вариантов с высоким риском был выше у CMP без HCM, в которых варианты, кодирующие белок, составляют лишь небольшую часть случаев. В целом, регуляторные варианты были обогащены не только путями, связанными с сокращением мышц, но также связыванием α-дистрогликана, десмосомной передачей сигналов и передачей сигналов ERK / Ras. Хотя кодирующие варианты в этих путях обычно вызывают мультисистемное вовлечение, мы не наблюдали системных особенностей у пациентов, несущих некодирующие варианты этих генов.Возможно, что действие регуляторных вариантов ограничено сердцем, в отличие от кодирующих вариантов, которые влияют на функцию белка во многих тканях. Кроме того, саркомерные гены менее подвержены влиянию регуляторных вариантов, вероятно, потому, что они более толерантны к гапло-недостаточности.

Известный набор генов с дисрегулируемой экспрессией включал DTNA, FKTN, FKRP, LARGE1 и POMT , которые необходимы для функции α-дистрогликана посредством посттрансляционного гликозилирования.Дистрогликан является центральным компонентом комплекса дистрофин-гликопротеин, где он действует как трансмембранный линкер, прикрепляя цитоскелет к внеклеточному матриксу и играет роль в стабильности миоцитов, сарколеммы и саркомеров ^61,62 . Нарушение гликозилирования было связано с тяжелой сердечной дисфункцией у FKTN или LARGE1-дефицитных мышей и с DCM (с легким или отсутствующим вовлечением скелетных мышц) часто в контексте гомозиготных или сложных гетерозиготных вариантов ^63–65 .Мы также обнаружили обогащение регуляторных вариантов, нарушающих экспрессию десмосомных генов ( DSG2, DSC2, JUP, DSP ), в которых, как сообщалось, оба варианта missense и LoF вызывали AVC, DCM и RCM, аналогично пациентам в нашей когорте ⁶⁶ .

Сильной стороной нашего исследования была возможность функционально проверить влияние регуляторных вариантов на экспрессию генов и белков. Мы подтвердили, что активность репортерного гена люциферазы изменялась под действием вариантных последовательностей промотора / энхансера по сравнению с контролем дикого типа в кардиомиоцитах человека ^67,68 .Мы признаем, что анализы репортера люциферазы не в состоянии оценить регуляторные варианты, которые влияют на структуру хроматина. Однако мы определили промоторы генов CMP путем слияния пиков ДНКазы-seq открытого хроматина и гистоновых меток, специфичных для промоторов и энхансеров, полученных из сердечной ткани. Более того, мы смогли показать, что экспрессия эндогенных генов была изменена в миокарде ЛЖ пациентов, несущих эти варианты, что поистине уникальное преимущество нашего исследования. Например, повышенная регуляция TGFB3 в миокарде наблюдалась у пациентов с DCM или HCM, но это первый случай, когда вариант регуляторного элемента этого гена связан с повышенной экспрессией TGFB3 в миокарде пациента ^69,70 .Сходным образом, насколько нам известно, это первое сообщение о сниженной экспрессии целевого гена в миокарде пациентов, несущих варианты промотора Tier 1, а также тех, у кого есть CNVs, включающие гены-кандидаты CMP ^71–74 . Важно отметить, что с помощью MPRA мы смогли продемонстрировать значительный регуляторный эффект большего подмножества вариантов с высоким риском, связанных с этими генами, усиливая силу нашей стратегии выбора вариантов ^75–78 . Вместе эти находки не только представляют собой важный прогресс в нашем понимании сердечной регуляции, но также предоставляют новое понимание геномной архитектуры детского CMP и добавляют к открытию некодирующих вариантов в человеческих заболеваниях ²¹ .

Как и в предыдущих отчетах, мы обнаружили несколько вариантов кодирования в 5% случаев, которые, как сообщалось, вносили вклад в более тяжелый фенотип ⁷⁹ . В нашей когорте мы также смогли обнаружить совместную встречаемость не только кодирующих SNV, но и CNV. Два пациента с ГКМП, один с патогенным MYBPC3 SNV и MYOM1 CNV умерли, а другой с вариантом сайта сплайсинга LoF в FLNC и делецией CNV в CTNNA3 потребовалась трансплантация сердца в течение первого года жизни. .Особенно любопытным открытием нашего исследования было то, что до 14% случаев имели несколько вариантов регуляции высокого риска, иногда в сочетании с вариантом патогенного кодирования. Все эти варианты были обнаружены в генах, важных в структуре миоцитов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы изучить связь нескольких вариантов регуляции с тяжестью заболевания.

Роль регуляторных вариантов могла быть недооценена в нашем исследовании, так как мы не изучали дистальные энхансеры. Кроме того, TFBS, которые не похожи на согласованную последовательность, могли быть ошибочно классифицированы как не относящиеся к группе высокого риска.Поскольку прогнозы in silico со временем улучшаются, это позволит более широко изучить регулом для вариантов заболевания. Наконец, мы были ограничены в нашей способности оценивать экспрессию эндогенных генов из-за небольшого количества доступных образцов миокарда.

В целом, наши выводы о том, что варианты с высокой степенью достоверности, идентифицированные с использованием моделей прогнозирования in silico , имеют функциональные последствия, подтверждают наш биоинформатический подход к открытию новых вариантов и дают веские основания для изучения вариантов в рекуррентно мутировавших цис-регуляторных элементах генов CMP с целью увеличить результативность генетического тестирования ^80,81 .Таким образом, наша работа обеспечивает руководящую стратегию для решения регуляторных вариантов сердечных заболеваний и подчеркивает необходимость дальнейших исследований для подтверждения клинической применимости этих результатов.

МЕТОДЫ

Когорта исследования

Когорта исследования включала несвязанные первичные пациенты с индексом CMP в возрасте до 21 года на момент постановки диагноза, а также затронутых и незатронутых членов семьи, набранных в период с 2007 по 2018 год через Биобанк кардиологического центра при Больнице для больных детей, Торонто ⁸⁰ .HCM, DCM, RCM, LVNC и AVC были диагностированы на основании опубликованных клинических критериев ^82,83 . Были исключены пациенты со вторичными БКМ, возникшими в результате врожденных нарушений метаболизма, митохондриальных нарушений, синдромной и нервно-мышечной этиологии. Были собраны клинические данные, включая демографические данные, диагноз, семейный анамнез, результаты клинического генетического тестирования и исходы во время последующего наблюдения. Средний возраст на момент постановки диагноза составлял 2,8 года (диапазон 0-20), 42% составляли женщины. Основными этническими группами, о которых сообщают сами респонденты, были 71% белых, 17% азиатов, 6% чернокожих.26% случаев были генотип-положительными при предыдущем клиническом панельном тестировании, 47% были генотип-отрицательными и 27% клинически не тестировались. Десять пациентов (4,7%) умерли, и 130 пациентов (57%) испытали серьезное неблагоприятное сердечно-сосудистое событие при последующем наблюдении ( Дополнительная таблица 1 ). Сбор и использование ДНК человека и ткани миокарда от пациентов с CMP через Реестр биобанков кардиологического центра было одобрено Советом по этике институциональных исследований (Больница для больных детей, Детская больница Восточного Онтарио, Общая больница Торонто, Лондонский центр медицинских наук, Кингстонская больница общего профиля , и Hamilton Health Sciences Center), и письменное информированное согласие было получено от всех пациентов и / или их родителей / законных опекунов ^80,81 .

Секвенирование всего генома (WGS)

WGS было выполнено на высококачественной ДНК из крови или слюны для достижения минимального 30-кратного покрытия с использованием платформы Illumina HiSeq X через Macrogen, Южная Корея, и Центр прикладной геномики (TCAG, Больница для больных детей, Торонто). Высококачественные считывания с парных концов (2 × 150 п.н.) были сопоставлены с эталонной последовательностью генома человека (hg19) с использованием выравнивателя Isaac, и варианты были вызваны с использованием вызывающего варианта Isaac варианта ⁸⁴ . Метрики качества WGS были рассчитаны с использованием mosdepth (https: // github.com / brentp / mosdepth) ⁸⁵ . Образцы со средним охватом всего генома менее 10X были исключены из дальнейшего анализа. Варианты, передающие стандартные метрики качества вызывающего варианта Isaac, были аннотированы с помощью snpEff (v.4.3) ⁸⁶ и annovar (v.2016.02.01) ⁸⁷ . Варианты, используемые для последующего анализа, дополнительно должны были иметь флаг «PASS» в поле «FILTER». SNV дополнительно требовалось, чтобы общая глубина отфильтрованного чтения (‘DP’) ≥ 10X, в то время как indel дополнительно требовалось, чтобы общая отфильтрованная глубина считывания в позиции, предшествующей indel (‘DPI’) ≥ 10X.Общее количество SNV на выборку было рассчитано с помощью bcftools ⁸⁸ .

Варианты кодирования белков в генах CMP

Путем анализа данных из базы данных Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), различных коммерчески доступных панелей генов CMP, ручного отбора из литературы, мы составили первичный список из 133 генов-кандидатов с сильной ассоциацией с CMP ( Дополнительная таблица 2 ). Митохондриальные гены были исключены. Мы разработали вычислительные рабочие процессы для интерпретации SNV (missense, splicing, LoF), indels и CNV в областях кодирования и некодирования.

SNV, кодирующие белки, и индели

Мы разработали рабочий процесс индивидуальной классификации вариантов для идентификации кодирующих патогенные белки и SNV сайтов сплайсинга на основе руководящих принципов ACMG 2015 ²⁴ . Система автоматической классификации вариантов была основана на информации из различных источников, включая ClinVar ⁸⁹ и базу данных мутаций генов человека (HGMD) ⁹⁰ , чтобы определить патогенные или вероятные патогенные варианты, о которых ранее сообщалось. 1000 геномов ⁹¹ , NHLBI-ESP ⁹² , Exome Aggregation Consortium (ExAC) и база данных агрегации генома (gnomAD) были использованы в качестве контрольных образцов для фильтрации редких вариантов, определенных как MAF <0.01% ⁹³ . Патогенность миссенс-вариантов была предсказана с использованием оценок прогноза по крайней мере из пяти инструментов прогнозирования, включая SIFT ⁹⁴ , PolyPhen2 ⁹⁵ , MutationTaster2 ⁹⁶ , Mutation Assessor ⁹⁷ , CADD ²⁷ , PROVEAN ²⁵ значение из пакета PHAST для множественного выравнивания 99 геномов позвоночных с геномом человека (phyloP100way_vertebrate) ⁹⁸ , MetaSVM и MetaLR ²⁶ . Оценка сохранности генома была получена из GERP ++ ⁹⁹ и phastCons ¹² .Предполагаемые варианты усечения белков, которые, по прогнозам, вызывают потерю функции, включая варианты сайта сплайсинга, бессмысленные варианты и варианты со сдвигом рамки, были оценены и аннотированы с помощью инструмента LOFTEE (https://github.com/konradjk/loftee) в качестве подключаемого модуля через Ensembl Variant Effect Predictor (VEP v90) инструмент ¹⁰⁰ . Патогенность вариантов, выявленных в ходе клинических испытаний, была подтверждена с использованием классификаций ClinVar ⁸⁹ и InterVar ¹⁰¹ , где это возможно. Сегрегация и анализ de novo были выполнены для всех вариантов, когда WGS из членов семьи был доступен.SNV и индели в генах CMP, которые соответствовали критериям патогенности, описанным выше, и которые, кроме того, имели MAF <0,01% в эталонной популяции gnomAD v2.1.1, считались причинными для CMP. Эти вероятные причинные варианты были рассмотрены и подтверждены посредством независимой классификации институциональной лабораторией молекулярно-генетического тестирования, и все зарегистрированные SNV были подтверждены с использованием секвенирования по Сэнгеру, где это возможно.

CNV, кодирующие белки

Для вызова CNV используются два алгоритма на основе глубины чтения, ERDS v1.1 (оценка по глубине чтения с SNV) ¹⁰² и CNVnator v0.3.2 ¹⁰³ , использовались, как описано ранее ²⁹ . Выявленные области CNV были аннотированы с помощью специального конвейера аннотаций, разработанного в TCAG. Чтобы повысить достоверность звонков, в последующий анализ были включены только области CNV размером> 1kb с как минимум 50% взаимным перекрытием между вызовами ERDS и CNVnator и <70% перекрытием с теломерами, центромерами и сегментарными дупликациями. Редкие CNV были определены как варианты, встречающиеся с частотой <1% в более чем 1500 контрольных образцах родительских образцов из когорты аутистов, MSSNG ¹⁸ .Используя карту CNV генома человека ³⁰ , события CNV, перекрывающие области CNV, которые были подвержены количеству копий <30%, были приоритетными для последующих анализов. Редкие CNV размером> 1 КБ, влияющие на кодирующие экзоны, были проверены вручную с использованием чтения из файлов BAM и дополнительно проверены с помощью qPCR со 100% соответствием. Пациенты, у которых не было хотя бы одного причинного варианта (т.е. редкий, кодирующий белок патогенный SNV или CNV в генах CMP), считались неуловимыми для генов, и их дополнительно оценивали на предмет кодирующих белки вариантов в новых генах и в регуляторных элементах известных CMP. гены.

Анализ вариантов De novo

Полные трио родитель-потомок были доступны в 22 случаях. Чтобы идентифицировать варианты de novo, мы создали полный набор инструментов анализа генома (GATK) / v4.1.2.0 передовой опыт ¹⁰⁴ локально для совместного вызова коротких вариантов (SNV и indels) в нашей когорте. Необработанные считывания с парных концов были сначала обрезаны и очищены с помощью trimmomatic v.0.32, затем сопоставлены с эталонным геномом человека GRCh47 для каждого образца с помощью bwa v.0.7.15. Эталонная последовательность генома и обучающий набор данных были загружены с сайта пакета GATK (ftp.broadinstitute.org/bundle/b37). Сопоставленные показания были повторно согласованы и откалиброваны с помощью инструментов перекалибровки базовой оценки качества (BQSR). HaplotypeCaller использовался для создания файлов генотипа VCF (gVCF) для каждого образца. Наконец, файлы gVCF для всех образцов были объединены и вызваны совместно с помощью инструментов CombineGVCFs и GenotypeGVCFs. Чтобы отфильтровать вероятные артефакты в вызовах, SNP и инделки были повторно откалиброваны отдельно инструментами Variant Quality Score Recalibration (VQSR) и вариантами, которые прошли уровень достоверности VQSR 99.5 для SNP и 99.0 для инделей. Мы развернули рабочий процесс уточнения GATK, чтобы идентифицировать варианты de novo, которые были признаны патогенными или вероятными патогенными в соответствии с критериями ACMG. Чтобы сделать вывод о возможных сайтах de novo с высокой степенью достоверности, мы сначала пересчитали вероятности генотипов образцов в масштабе phred, введя набор вызовов проекта «1000 геномов» (1000G_phase3_v4_20130502) и родословные троек. Эти дополнительные данные могут использоваться в качестве предварительных данных для повторной калибровки достоверности генотипов, а не только для расчета вероятности генотипа образца только по его считыванию.На этом этапе был применен инструмент CalculateGenotypePosteriors. Затем мы использовали VariantFiltration, чтобы выделить сайты с низким качеством генотипа (GQ), значения GQ которых были ниже 20, а глубина считывания была ниже 10. Наконец, только сайты со всеми номерами трио ≥ GQ 20 были определены как сайты с высоким уровнем достоверности de novo. варианты в окончательном наборе вызовов.

Кодирующие белки варианты LoF в новых генах CMP

Чтобы идентифицировать новые предполагаемые гены CMP помимо 133 установленных генов CMP, мы провели поиск предполагаемых вредных гетерозиготных и гомозиготных вариантов LoF (т.е.е. варианты со сдвигом рамки считывания, бессмыслица, временная задержка, стоп-лосс и сплайсинг) в остальной части экзома среди случаев CMP, которые действительно несли патогенный кодирующий белок или регуляторный вариант высокого риска в гене CMP. Варианты LoF были идентифицированы с использованием LOFTEE (https://github.com/konradjk/loftee) ^32,33 . Все варианты LoF должны были быть предсказаны как высокоэффективные с помощью VEP ¹⁰⁰ , наблюдаемые при частоте аллелей <0,01% в эталонной популяции gnomAD, наблюдаемые в <1% неродственных семей в когорте и влияющие на гены, которые экспрессируются в человеческое сердце.Варианты дополнительно определялись по приоритету, если они принадлежали к сильно ограниченному гену (gnomAD pLI> 0,9) и / или были важны для функции сердца. Категории уровней экспрессии генов в тканях были получены из Атласа белков человека (http://www.proteinatlas.org) ³⁵ .

SNV и CNV в регуляторных элементах генов CMP

Была создана карта регуляторных областей генома человека, в первую очередь промоторов, проксимальных и дистальных энхансеров, активных в развивающемся сердце и сердце взрослого человека, на основании экспериментальных данных и данных Проект энциклопедии элементов ДНК (ENCODE) ⁴⁷ , проект FANTOM ⁴⁶ , эпигеномика дорожной карты ⁴⁹ и опубликованные данные Дикеля и др. ⁴⁸ .Промоторные области всех генов CMP, не включенных Dickel et al, были определены как 1,5 т.п.н. выше и 1,25 т.п.н. от сайта начала транскрипции (TSS). TSS для канонических транскриптов и, при необходимости, сердечных транскриптов в сборке 37 генома человека (hg19) были загружены из Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org — по состоянию на октябрь 2017 г.). Чтобы идентифицировать SNV риска в определенных регуляторных областях генов CMP, был разработан и реализован автоматизированный конвейер приоритизации вариантов без кодирования.Вкратце, варианты в определенных регуляторных областях аннотировали с использованием Ensembl’s Variant Effect Predictor (VEP v90) ¹⁰⁰ . Варианты, частично совпадающие с известными регуляторными характеристиками Ensembl, сравнивали с вариантами, выявленными в данных WGS в контрольных популяциях в gnomAD (n = 141 456). Регуляторные регионы перечислены в дополнительной таблице 9 . Функциональное влияние редких регуляторных вариантов оценивалось на основе баллов создания или разрушения TFBS. Баллы для разрушения TFBS (потеря мотива) и создания TFBS (усиления мотива) были основаны на комбинированных оценках прогнозов из четырех различных инструментов — RegulomeDB ⁵⁰ , motifbreakR ⁵¹ , DeepSEA ⁵² и Fathmm-MKL ¹⁰⁵ .Варианты считались Уровнем 1 и оценивались как разрушающие по крайней мере 3 из 4 инструментов прогнозирования (Уровень 1). Регуляторные варианты были дополнительно расставлены по приоритету, если они встречались в неуловимых генах случаев CMP, были связаны с геном, имеющим OR> 1,3 по сравнению с контрольной когортой ICGC, и находились в области, которая активна в LV человека. Межгенные и интронные CNV, а также перекрывающиеся промоторы indels <1kb и энхансеры, активные в развивающемся и взрослом сердце человека, как определено Dickel et al. ⁴⁸ , также были приоритетными.

Анализ бремени регуляторных вариантов «случай-контроль»

Вызов вариантов WGS было получено от 1326 пациентов без сердечных заболеваний, включенных в Международный консорциум генома рака (ICGC) ⁵⁴ . Образцы WGS были получены из нормальной ткани, 998 из которых состояли из крови, 224 из твердых тканей из участка, удаленного от первичной опухоли, 76 прилегающих твердых тканей и 28 других тканей. Пациенты включали 579 женщин и 747 мужчин; диагнозы включали 286 рака поджелудочной железы, 221 рак мозга, 178 рака простаты, 123 рака груди, 98 рака пищевода, 82 рака печени, 74 рака почек, 70 рака кожи, 68 рака яичников, 64 рака костей, 37 рака желудка, 13 рака полости рта, и 12 видов рака желчных путей.Данные были получены из раздела Панорамного анализа целых геномов портала данных ICGC (PCAWG). Образцы были сопоставлены с hs37d5 (GRCh47), и вызовы вариантов зародышевой линии были сделаны с использованием конвейера вызова вариантов DKFZ / EMBL. «НОРМАЛЬНЫЕ» выборочные вызовы были извлечены и отфильтрованы аналогично когорте обнаружения: для последующего анализа использовались только варианты с флагом «PASS», охваченные как минимум 10 чтениями (DP / DPI ≥10). Вызовы вариантов были преобразованы в hg19 с помощью Picard LiftoverVcf (http: // broadinstitute.github.io/picard/).

Чтобы сравнить бремя вариантов между случаями и контролями для вариантов уровня 1 в регуляторных элементах генов CMP, требовалось, чтобы вызовы вариантов имели частоту аллелей ≤0,01% в gnomAD. Варианты, наблюдаемые в ≥1% образцов в исследуемой когорте, были исключены из нагрузочного тестирования, чтобы уменьшить количество ложноположительных вариантов. Для каждого сравнения (ген, путь или весь регулом) OR были рассчитаны как частота случаев по сравнению с контролями, содержащими хотя бы один вариант.P-значения были рассчитаны с использованием двустороннего точного критерия Фишера. Пороговое значение коэффициента ложного обнаружения (FDR) 0,2 было применено после удаления тестов, в которых не наблюдались варианты в комбинированном случае и контрольной выборке. Чтобы уменьшить смещение в этих расчетах и ​​избежать «нулевых ячеек» в таблицах непредвиденных обстоятельств, к каждой наблюдаемой частоте было добавлено 0,5 (поправка Холдейна-Анскомба). Все статистические анализы были выполнены с использованием статистического программного обеспечения R версии 3.5.1.

Когортный анализ репликации

Анализ бремени регуляторных вариантов был расширен до независимой когорты из 1266 случаев CMP с использованием образцов из проекта 100000 Genomes Project, доступных нам через Genomics England Clinical Interpretation Partnership из версии 8 основной программы 94

Иммуногистохимия (IHC)

Фиксированная формалином и парафиновая заделка (FFPE) ткань LV от пациента с CMP с вариантом промотора LARGE1 и контроля без LARGE1 вариантов были использованы для анализа IHC с использованием стандартных методов ¹¹⁶ .Блоки ткани FFPE были разрезаны на 4 мкм, депарафинированы в ксилоле, обезвожены с помощью серийных разведений раствора этанола и промыты PBS. Извлечение антигена проводили в растворе для извлечения мишени (Dako, Burlington, ON, Canada) в течение 45 минут с последующим блокированием тканей 3% пероксидазой водорода (H ₂ O ₂ ) в течение 10 минут. После промывания PBS срезы тканей инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с первичным антителом против LARGE1 (PA5-78393, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) с последующей инкубацией срезов с биотинилированным вторичным антителом в течение еще 30 мин ( Дополнительная таблица 12) .Иммуномечение выявляли с помощью наборов EnVision + System-HRP DAB (Dako, Burlington, ON, Canada). Срезы были исследованы и отображены с помощью светового микроскопа. Ядра клеток контрастировали с помощью гистологического окрашивающего реагента Myer’s Hematoxylin (Dako, Burlington, ON, Canada). Фотографии были проанализированы с помощью программного обеспечения для автоматического анализа изображений (Image J, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд). Количество LARGE1-положительных клеток усредняли в 10 полях на срез и повторяли в 3-х повторах.Окрашивание сравнивали между индивидуумом, несущим вариант LARGE1 , и контролями. Непарный t-критерий Стьюдента использовался для определения различий между группами. Значение p <0,05 считалось значимым.

Репортерные анализы кардиомиоцитов, полученных из ИПСК человека

Генерация кардиомиоцитов ИПСК человека

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из лимфоцитов периферической крови здорового взрослого донора (PGP17), были дифференцированы в кардиомиоциты (CM) Набор для дифференциации кардиомиоцитов STEMdiff.Линия ИПСК PGP17_11 лишена каких-либо известных вариантов сердечных заболеваний, и протокол дифференцировки в кардиомиоциты был ранее описан ¹¹⁴ . Биение дифференцированных кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, наблюдалось на 8-й день после дифференцировки. Клетки повторно высевали на 16 день в 12-луночные планшеты для временной трансфекции. Кардиомиоциты котрансфицировали люциферазными конструкциями на 21 день. Трансфицированные клетки собирали через 48 часов после трансфекции, и активность люциферазы светлячка и рениллы измеряли с использованием системы анализа Dual-Luciferase® Reporter.

Анализ репортерной люциферазы

Для функциональной проверки влияния вариантов на транскрипцию гена использовали систему репортерного анализа Dual-Luciferase® (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) для тестирования и сравнения транскрипционной активности репортерного гена люциферазы под действием эффекта. вариантного промотора или энхансера + промоторная последовательность от пациента, или эталонной последовательности генома каждой регуляторной области в качестве контроля дикого типа ^67,68 . Для создания люциферазных плазмид, несущих последовательность регуляторного элемента предсказанных вариантов и дикого типа в качестве контроля, нуклеотидные последовательности 1.Были коммерчески синтезированы 5-килобайтные промоторные области BRAF, DSP, DTNA, FKRP, FKTN и LARGE1 , а также 2-килобайтные энхансерные / промоторные области TGFB3 , содержащие наиболее сильную область транскрипционной активации ( Дополнительная таблица 13 ) (Synbio Technologies, Monmouth Junction, NJ, USA). Коммерческие плазмиды, кодирующие соответствующие последовательности дикого типа, энхансера или варианта промотора, расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами и клонировали отдельно во множественные сайты клонирования основных векторов люциферазы Firefly (pGL4.10-люк2; Промега, Мэдисон, Висконсин, США). Кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека, высевали в 12-луночные планшеты и котрансфицировали 2 мкг векторов люциферазы светлячков (pGL4.10-luc2; Promega, Мэдисон, Висконсин, США), несущих регуляторные последовательности дикого типа, BRAF, DSP, Варианты DTNA, FKRP, FKTN и LARGE1 или TGFB3 и 40 нг репортерных векторов контроля люциферазы Renilla (вектор pRL-TK; Promega, Мэдисон, Висконсин, США) для нормализации условий трансфекции.Через 48 ч после трансфекции люминесценцию детектировали с помощью системы анализа Dual-Luciferase® Reporter (DLR ™). Эксперимент проводили в трех независимых повторах, и каждый образец также тестировали в трех повторах в каждом эксперименте. В той же лунке измеряли люциферазу светлячка, а затем люциферазу Renilla. Нормализующую активность экспериментального репортера рассчитывали путем деления сигнала люциферазы светлячка на сигнал внутренней люциферазы рениллы. Управляемый промотором контрольный вектор люциферазы светлячка (pGL4.13-люк2 / SV40; Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Непарный двусторонний t-критерий Стьюдента использовали для сравнения, есть ли разница между люциферазной активностью репортерного гена люциферазы под действием регуляторной вариантной последовательности и эталонной последовательностью каждой регуляторной области в качестве контроля дикого типа. Порог значимости был установлен на уровне p <0,05.

Массивно-параллельный репортерный анализ (MPRA)

Олигонуклеотиды длиной 135 п.н. со штрих-кодами из 11 п.н. были разработаны и синтезированы TwistBioscience (США).Варианты были сосредоточены в пределах олигонуклеотида 135 п.н. Полный список протестированных вариантов можно найти в дополнительной таблице 6 . Для контроля технических вариаций и оценки биологической значимости каждый протестированный аллель был представлен как минимум 25 раз, каждый с уникальным штрих-кодом. Библиотека олигонуклеотидов содержала 2700 олигонуклеотидов для наших геномных вариантов, 100 олигонуклеотидов для положительных контролей и 1500 олигонуклеотидов для отрицательных контролей, то есть скремблированных последовательностей. Эти олигонуклеотиды были частью библиотеки олигонуклеотидов, которая включала дополнительные 234 500 последовательностей в рамках более крупного исследования.Стратегию клонирования библиотеки олигонуклеотидов и отбор положительных отрицательных контролей (300 случайных последовательностей, каждая с 5 штрих-кодами) выполняли согласно Mattioli et. al ²³ . Библиотеку олигонуклеотидов трансфицировали в пять биологических повторений кардиомиоцитов, полученных из ИПСК PGP17, с эффективностью трансфекции более 80% во всех повторностях, используя реагент для трансфекции ствола липофектамина (STEM00015 Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) (, дополнительная фигура 3b, ).Через 48 часов после трансфекции собирали тотальную РНК и удаляли загрязнения ДНК с использованием ДНКазы I (18047019, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA). Образцы РНК с числом целостности РНК> 7 использовали для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы SuperScript IV (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). кДНК использовали для синтеза библиотеки, если в ней отсутствовала контаминация плазмид, как определено с помощью qRT-PCR, выполненной в системе qPCR ViiA7 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) с использованием PowerUp SYBR ^™ Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США) ( Дополнительный рисунок 3c ).Библиотеки Tag-seq получали, как описано ранее ²³ , и секвенировали с односторонним считыванием 50 п.н. на платформе HiSeq2500 (TCAG, Госпиталь для больных детей, Торонто). Данные анализировали с использованием программного обеспечения MPRAAnalyze ^23,117 , используя случайные олигонуклеотидные последовательности в качестве нулевого распределения. Значения P были рассчитаны с использованием теста отношения правдоподобия с MPRAAnalyze, и значение FDR <0,05 считалось значимым.

Редактирование CRISPR-Cas9 для оценки функции нового гена в эмбрионах рыбок данио

Все исследования эмбрионов рыбок данио были выполнены в Центре генетики и моделей заболеваний SickKids (ядро рыбок данио), Торонто, и одобрены Комитетом по уходу за животными SickKids (Протокол № 401951) .

Дизайн, синтез и микроинъекция направляющей РНК (gRNA)

Все последовательности gRNA были адаптированы из ⁴⁵ и описаны в Supplementary Table 14 . Последовательности праймеров ( Дополнительная таблица 15 ) были синтезированы с помощью Integrated DNA technologies (IDT, Coralville, Iowa, USA) и использованы для синтеза sgRNA in vitro в соответствии с ранее описанным протоколом ⁴⁵ . Микроинъекции выполняли, как описано ранее ⁴⁵ с небольшими изменениями.Вкратце, для nrap гРНК1, 250 пг каждой гРНК с 800 пг белка Cas9 (нуклеаза V3 Alt-R ^® Sp Cas9, номер по каталогу 1081058, IDT, Коралвилл, Айова, США) совместно вводили в клетки дикого типа. эмбрионы на одной клеточной стадии. Для совместной инъекции 8 гРНК fhod3a + b , gRNA1-gRNA4 вводили 125 пг каждой гРНК, при этом количество белка Cas9 оставалось неизменным. Введенные эмбрионы содержались в 0,003% растворе фенилтиомочевины (PTU) и инкубировались в темном инкубаторе при 28,5 ° C в течение 3 дней.Весь фенотипический анализ, визуализация, выделение ДНК и секвенирование были выполнены через 3 дня после оплодотворения (dpf).

Экстракция ДНК, ПЦР и анализ последовательности

Неочищенную ДНК экстрагировали из целых личинок рыбок данио с использованием буфера 1X-PCR (10 мМ KCl, 10 мМ Tris, PH 8,0; 1,5 мМ MgCl2), содержащего 1 мг / мл протеиназы K (Thermo Scientific , Уолтем, Массачусетс, США). Смесь инкубировали при 55 ° C в течение 50 минут, а затем при 98 ° C в течение 10 минут для деактивации протеиназы K. Для секвенирования каждой области гРНК проводили ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Taq (Bio basic, Markham, ON, Канада).25 мкл реакционной смеси содержали буфер для реакции 1X-PCR, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мМ каждого прямого и обратного праймеров, 0,75 ед. Полимеразы Taq и 1,5 мкл неочищенной ДНК (~ 200 нг). Пары праймеров и соответствующие им температуры отжига приведены в дополнительной таблице № 15 . Реакции ПЦР были установлены следующим образом: 95 ° C в течение 5 минут, затем 35 циклов при 95 ° C в течение 20 секунд, температура отжига в течение 1 минуты, 72 ° C в течение 1 минуты и конечная элонгация 72 ° C в течение 5 минут. . Продукт ПЦР очищали с помощью ExoSAP-IT (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя, и 100 нг каждого продукта ПЦР отправляли для секвенирования в TCAG (Торонто, Онтарио, Канада) с праймерами для секвенирования, описанными в . Дополнительная таблица 15 .Результаты секвенирования анализировали с помощью ICE Analysis (https://ice.synthego.com/#/) или Geneious 9.1.4.

qRT-PCR

При 3 dpf объединенные образцы РНК собирали либо от личинок рыбок данио, которым инъецировали гРНК целевых генов, либо только Cas9 в качестве контроля с использованием реагента TRIzol ™ (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). КДНК первой цепи синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) в соответствии с инструкциями производителя.Праймеры, перечисленные в дополнительной таблице 16 , использовали для амплификации двух эталонных генов β –актин и GAPDH для нормализации данных. Анализ qRT-PCR проводили в приборе Roche LightCycler 96 с использованием смеси PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Относительный уровень экспрессии рассчитывали на основе двух технических повторов с использованием метода 2 ^{-ΔΔCT 113} .

Секвенирование

образцов ДНК были выделены из целых личинок рыбок данио при 3 dpf и отправлены на секвенирование по Сэнгеру в TCAG (Торонто, Онтарио, Канада) для подтверждения эффективности разрезания экзонов, нацеленных на nrap, fhod3a и fhod3b gRNA. по сравнению с Cas9 только в качестве контроля.Инструмент анализа ICE CRISPR (Synthego, Menlo Park, CA) использовался для анализа изменений CRISPR в fhod3b .

Сердечное фенотипирование рыбок данио

Сердечное фенотипирование эмбрионов рыбок данио было выполнено при 3 dpf для оценки морфологии, размера и функции сердечной камеры. Для получения изображений с помощью микроскопа in vivo , 3 личинки рыбок данио dpf анестезировали 0,02% трикаином и помещали в 3% метилцеллюлозу в чашки со стеклянным дном 50 мм. Видеоизображение было выполнено с помощью микроскопа Zeiss AXIO Zoom V16 с использованием PlanNeoFluar Z 1X / 0.Объектив 25 FWD 56 мм с увеличением 112x. Была использована функция Movie Recorder в программе Zen pro, и для каждого видео было снято примерно 100 кадров. Все видео были экспортированы со скоростью 17 кадров в секунду для дальнейшего анализа. Изображения были получены с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ti в системе конфокальной визуализации Nikon A1 plus с использованием программы NIS-Elements. Площадь предсердий измеряли в конце систолы, а площадь желудочков измеряли в конце систолы и в конце диастолы с фракцией выброса желудочков, определяемой как (конечная диастолическая площадь — систолическая площадь желудочков) / конечная систолическая площадь желудочков x 100 с использованием ImageJ (). https: // imagej.nih.gov/ij/ ). Размеры предсердий и желудочков и фракция выброса желудочков сравнивали с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента для измерения значимых различий между мутантами ( nrap и fhod3 ) и контролями (Cas9 и дикого типа). Различия считали статистически значимыми при P <0,05.

Доступность данных

Данные секвенирования в настоящее время хранятся в Европейском архиве генома-фенома EGA и будут доступны для загрузки после утверждения Комитетом по доступу к данным.Дополнительные данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в файлы дополнительной информации, а дополнительные необработанные данные, используемые для рисунков и результатов, доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу. Все вычислительные инструменты, использованные в этом исследовании, доступны как коммерческое программное обеспечение или программное обеспечение с открытым исходным кодом.

Доступность данных

Данные секвенирования в настоящее время хранятся в Европейском архиве генома-фенома EGA и будут доступны для загрузки после утверждения Комитетом по доступу к данным.Дополнительные данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в файлы дополнительной информации, а дополнительные необработанные данные, используемые для рисунков и результатов, доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу. Все вычислительные инструменты, использованные в этом исследовании, доступны как коммерческое программное обеспечение или программное обеспечение с открытым исходным кодом.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа финансировалась Центром исследований сердца Теда Роджерса (SM и JE). SM владеет канадским фондом сердца и инсульта / кафедрой свободы Роберта М. в области сердечно-сосудистых исследований.SWS является заведующим кафедрой геномных наук GlaxoSmithKline в Больнице для больных детей и Университете Торонто. PGM занимает должность канадского кафедры исследований 2 уровня по некодирующим механизмам заболеваний. PGM выражает признательность за поддержку Правительству Канадского фонда новых границ в исследованиях (NFRF), [NFRFE-2018-01305]. Е.О. является профессором семьи Битове по врожденным порокам сердца у взрослых. MM имеет грант Ramon y Cajal от Министерства науки и инноваций Испании (RYC-2017-22249). WO поддерживается фондом Fundació La Marató (321 / C / 2019).JB финансируется стипендией Франса Ван де Верфа для клинических исследований сердечно-сосудистой системы и стипендией старшего клинического исследователя FWO Flanders. К.М. был научным сотрудником Национального научного фонда по гранту № DGE1144152 на протяжении большей части проекта. Проект «100 000 геномов» управляется Genomics England Limited (полностью принадлежащая Министерству здравоохранения и социальной защиты компания). Проект «100 000 геномов» финансируется Национальным институтом исследований в области здравоохранения и Национальной службой здравоохранения Англии.Wellcome Trust, Cancer Research UK и Совет медицинских исследований также финансировали исследовательскую инфраструктуру.

CONSORTIA

Исследовательский консорциум Genomics England

Ambrose, J. C. ¹ ; Arumugam, P. ¹ ; Baple, E. L. ¹ ; Bleda, M. ¹ ; Boardman-Pretty, F. ^1,2 ; Boissiere, J. M. ¹ ; Boustred, C.R. ¹ ; Brittain, H. ¹ ; Caulfield, M. J. ^1,2 ; Chan, G.C. ¹ ; Крейг, К.E. H. ¹ ; Daugherty, L.C. ¹ ; de Burca, A. ¹ ; Devereau, A. ¹ ; Elgar, G. ^1,2 ; Foulger, R.E. ¹ ; Fowler, T ¹ .; Furió-Tarí, P. ¹ ; Giess A. ¹ ; Hackett, J. M. ¹ ; Halai, D. ¹ ; Hamblin, A. ¹ ; Henderson, S. ^1,2 ; Holman, J. E. ¹ ; Hubbard, T. J. P. ¹ ; Ibáñez, K. ^1,2 ; Jackson, R. ¹ ; Джонс, Л.J. ^1,2 ; Kasperaviciute, D. ^1,2 ; Kayikci, M. ¹ ; Kousathanas, A. ¹ ; Lahnstein, L. ¹ ; Lawson, K. ¹ ; Leigh, S.E.A. ¹ ; Leong, I.U.S. ¹ ; Lopez, F. J. ¹ ; Maleady-Crowe, F. ¹ ; Mason, J. ¹ ; McDonagh, E. M. ^1,2 ; Moutsianas, L. ^1,2 ; Mueller, M. ^1,2 ; Murugaesu, N. ¹ ; Need, A.C. ^1,2 ; Odhams, C.A. ¹ ; Ориоли А. ¹ ; Patch, C. ^1,2 ; Perez-Gil, D. ¹ ; Pereira, M. B. ¹ ; Polychronopoulos, D. ¹ ; Pullinger, J. ¹ ; Rahim, T. ¹ ; Rendon, A. ¹ ; Riesgo-Ferreiro, P. ¹ ; Rogers, T. ¹ ; Ryten, M. ¹ ; Savage, K. ¹ ; Sawant, K. ¹ ; Scott, R.H. ¹ ; Siddiq, A. ¹ ; Sieghart, A. ¹ ; Smedley, D. ^1,2 ; Smith, K. R. ^1,2 ; Смит, С.C. ¹ ; Сосинского, А. ^1,2 ; Spooner, W. ¹ ; Stevens, H.E. ¹ ; Stuckey, A. ¹ ; Sultana, R. ¹ ; Tanguy M. ¹ ; Thomas, E. R.A. ^1,2 ; Thompson, S.R. ¹ ; Tregidgo, C. ¹ ; Tucci, A. ^1,2 ; Walsh, E. ¹ ; Watters, S.A. ¹ ; Welland, M. J. ¹ ; Williams, E. ¹ ; Witkowska, K. ^1,2 ; Wood, S. M. ^1,2 ; Заровецкий, М. ¹

^1. Genomics England, London, UK

^2. Исследовательский институт Уильяма Харви, Лондонский университет Королевы Марии, Лондон, EC1M 6BQ, UK.

ВКЛАД АВТОРА

RL, AS, JE, SM разработали концепцию и разработали работу; Получены, проанализированы или интерпретированы RL, AS, OA, JB, TL, RY, FM, RRN, AM, QY, GM, MCSY, WWL, BT, GERC, JL, EO, LB, JS, TM, JE, SWS, SM данные; RL, OA, TL, RY, MCSY, WWL, BT выполнили биоинформатический анализ; KM, KD, WO, MM, PGM разработали, выполнили и проанализировали набор данных MPRA; RL, AS, SM составили оригинал рукописи; RL, AS, PGM, JE, SWS, SM существенно изменили его; и все авторы просмотрели и одобрили окончательную рукопись.

КОНКУРЕНТНЫЕ ИНТЕРЕСЫ

SWS — научный консультант Научно-консультативного совета по Deep Genomics Population Bio, и его исследовательские патенты, хранящиеся в Больнице для больных детей, лицензированы Lineagen и Athena Diagnostics. Другие авторы не сообщают о конфликте интересов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЛЕГЕНДЫ ФИГУРЫ

Дополнительная фигура 1: Результаты секвенирования редактирования генов у рыбок данио . Секвенирование по Сэнгеру отредактированных генами рыбок данио (n = 7) выявило высокое бремя мутаций в экзонах, нацеленных на 4 гРНК для (a) nrap и (b) fhod3ab по сравнению с контролем только Cas9.Панели показывают эталонную последовательность, расположение гРНК, целевой экзон, эффект только Cas9 по сравнению с гРНК CRISPR / Cas9 в эмбрионах рыбок данио. SNV, инделки и большие делеции показаны коричневым и синим цветом. nrap, fhod3a и fhod3b gRNAs вызвали редактирование CRISPR во всех инъецированных эмбрионах и были проанализированы с использованием программного обеспечения Synthego ICE по мере необходимости.

Ref-seq, эталонная последовательность: гРНК, направляющая РНК; ICE, вывод CRISPR edits

Дополнительный рисунок 2: Пути, обогащенные кодирующими белками и регуляторными вариантами в общей когорте (n = 228) .( a ) Онтология генов (категория молекулярных функций) и пути Reactome обогащены патогенными вариантами кодирования и сплайсинга белков. ( b ) Пути, обогащенные регуляторными вариантами уровня 1 высокого риска, включая категории, связанные с мышцами, связывание дистрогликана, рецепторы фактора роста фибробластов и пути Ras.

Дополнительная фигура 3: Прогнозирующее влияние регуляторных вариантов на мотив связывания фактора транскрипции . SeqLogo использовался для прогнозирования нарушения мотива, вызванного вариантами в регуляторных элементах ( a, b ) BRAF , ( c ) DSP , ( d ) DTNA , ( e ) FKRP , ( f, g ) FKTN , ( h, i ) LARGE1 , ( j ) PRKAG2 и ( k ) TGFB3 .Пара нуклеотидных оснований, обведенная красным прямоугольником, указывает положение варианта в мотиве. Анализ регуляторной последовательности вариантов показывает изменение одного нуклеотида в каждом варианте по сравнению с эталонной последовательностью, что приводит к нарушению мотивов факторов транскрипции, которое, как предполагается, связано с повышающей или понижающей регуляцией транскрипции целевого гена.

Майор, контрольная последовательность; Риск, вариантная последовательность.

Дополнительный рисунок 4: Люциферазные анализы в CMs, полученных из hiPSC .( a ) Использовали векторы репортерного гена люциферазы, несущие различные промоторные последовательности. Управляемый промотором контрольный вектор люциферазы Firefly (pGL4-13_luc2_SV40) и базовый вектор люциферазы Firefly без промотора (pGL4-10-luc2) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Контрольные репортерные векторы Renilla Luciferase (вектор pRL_TK) использовали для нормализации условий трансфекции. Последовательности регуляторных элементов предсказанных вариантов и вариантов дикого типа были коммерчески синтезированы и клонированы отдельно во множественные сайты клонирования основных векторов люциферазы светлячка, pGL4.10_luc2. CMs, происходящие от hiPSC, котрансфицировали вектором люциферазы светлячка, несущим регуляторные последовательности отдельно, и контрольным репортерным вектором люциферазы Renilla. Люминесценцию детектировали с помощью системы анализа Dual-Luciferase® Reporter (DLR ™). ( b ) Успешная дифференцировка (окрашивание сердечного тропонина Т красным цветом) и трансфекция плазмиды pX601_GFP (зеленый) в кардиомиоциты, полученные из ИПСК PGP17 на 21 день, с использованием реагента для трансфекции ствола липофектамина. Увеличение: × 20. ( c ) qRT-PCR выполняли для обнаружения загрязнения ДНК в результате трансфекции пула плазмид 5 биологических повторов кардиомиоцитов PGP17.( d ) Унимодальное распределение штрих-кодов, которые представляют олигонуклеотиды, используемые в этом проекте. Ввод ДНК представляет собой пул плазмид олигонуклеотидов, в то время как реплики 1-5 (каждая репликация разделена на две дорожки HiSeq2500) проточных клеток представляют собой библиотеки tag-seq, полученные в результате трансфекций кардиомиоцитов. ( e ) Корреляция Пирсона для 5 повторов MPRA. hiPSC, индуцированная человеком плюрипотентная стволовая клетка; CM, кардиомиоциты; GFP, зеленый флуоресцентный белок; Р, плазмида; Пр, промоутер; En, Enhancer; Люк, Люцифераза; RES, последовательность регуляторного элемента, WT, дикий тип; V — вариант; rep, replicate

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТАБЛИЦЫ

Дополнительная таблица 1: Клинические характеристики пробандов детской кардиомиопатии в когорте обнаружения (n = 228).

Дополнительная таблица 2: Список генов кардиомиопатии.

Дополнительная таблица 3: Гены кардиомиопатии, несущие патогенные или вероятные патогенные кодирующие SNV и инделы (n = 228 несвязанных случаев).

Дополнительная таблица 4: вариантов количества копий, влияющих на гены кардиомиопатии (n = 228 несвязанных случаев).

Дополнительная таблица 5: Варианты потери функции в новых генах кардиомиопатии (n = 228 неродственных случаев).

Дополнительная таблица 6 : Варианты потери функции в NRAP и FHOD3 в когортах обнаружения кардиомиопатии (n = 228) и репликации (n = 1266).

Дополнительная таблица 7: SNV высокого риска (и кандидаты) уровня 1 в регуляторных элементах генов кардиомиопатии (n = 228 случаев)

Дополнительная таблица 8 : SNV уровня 1 в регуляторных элементах генов кардиомиопатии, оцененные MPRA (n = 228 случаев)

Дополнительная таблица 9: Регуляторные области генов кардиомиопатии для картирования некодирующих вариантов.

Дополнительная таблица 10: Нормализованные данные RNAseq для генов с CNV высокого риска, LoF и регуляторными вариантами

Дополнительная таблица 11: пар праймеров для qRT-PCR в миокарде LV генов-кандидатов, несущих регуляторные варианты.

Дополнительная таблица 12: Антитела, используемые для вестерн-блоттинга и иммуногистохимии

Дополнительная таблица 13: Синтез последовательностей промотора и энхансера гена для анализов люциферазы.

Дополнительная таблица 14: Дизайн одиночных направляющих РНК для нацеливания новых генов в эмбрионах рыбок данио.

Дополнительная таблица 15: пар праймеров для редактирования CRISPR-Cas9 новых генов в эмбрионах рыбок данио.

Дополнительная таблица 16: пар праймеров для qRT-PCR для новых генов, на которые нацелено редактирование гена CRISPR-Cas9 в эмбрионах рыбок данио.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим семейный кардиологический центр Лабатт Биобанк при больнице для больных детей за доступ к образцам ДНК для полногеномного секвенирования и Центр прикладной геномики при больнице для больных детей за выполнение секвенирования. Мы благодарим Xiucheng Cui и Emanuela Pannia за выполнение экспериментов с рыбками данио в SickKids Zebrafish Genetics and Disease Models Core (синтез CRISPR-Cas9 и gRNA, микроинъекции эмбрионов рыбок данио, валидация gRNA PCR, qRT-PCR, визуализация сердца).

alexxlab