Город детства снв: Ремонт с roof-city.ru | Делаем ремонт своими руками

Содержание

ЖК «Город детства» от СНВ, Коммунар, Ленинградская область

Жилой комплекс «Город детства» застройщика СНВ в Гатчинском районе Ленинградской области.

Жилой комплекс «Город детства» от строительной группы «СНВ» – одно из интереснейших предложений на рынке недвижимости, рассчитанных на проживание молодых семей с детьми. В реализации проекта использована палитра ярких красок, что придает комплексу нетривиальный внешний вид – здания, раскрашенные в радужные тона, создают солнечную атмосферу даже в пасмурную погоду.

При возведении жилых домов используются высококачественные материалы, что позволяет создать прочную конструкцию и исключить любые дефекты внутри помещений. Застройщик грамотно подошел к созданию концепции дизайна и планировке квартир, благодаря чему жители нового коттеджного поселка получат комфортное место жительства, которое выделяется превосходной отделкой помещений.

ЖК «Город детства» имеет выгодную транспортную локацию, развитую инфраструктуру и располагается на Железнодорожной улице, невдалеке от границы Санкт-Петербурга, в городе Коммунар Гатчинского района.

Изюминкой комплекса станет красочная игровая площадка с необходимым оборудованием для игр и безопасным прорезиненным покрытием.

Характеристика ЖК

Дома

Площадь участка, на котором разместится новый жилой комплекс, составляет 18 гектар. Это позволит  построить здания на оптимальном расстоянии друг от друга. В рамках проекта будет возведено 10 жилых домов, семь из которых будут иметь по 6 этажей, а остальные по три.

Жилые корпуса возводятся по современной энергосберегающей технологии с применением экологически безопасных строительных материалов — газобетона и кирпича, которые позволяют сохранять необходимый уровень тепло- и шумоизоляции в жилым помещениях. Фасады здания украсят яркие красочные тона, которые станут завершающим этапом воссоздания образа ЖК «Город детства».

Квартиры

В каждом жилом корпусе запроектировано от 30 до 60 квартир. Жилье предоставляется в черновом варианте, без проведения отделочных работ. Черновая отделка предполагает установку входных металлических дверей, монтаж радиаторов отопления с регуляторами и остекление лоджий и балконов.

Площадь квартир:

  • 1-комнтаные – 25,25,32,38 кв. м;
  • 2-комнатные – 42,48,49,56 кв. м;
  • 3-комнатные – 61 кв. м.

Высота потолков без стяжки составляет 2,95 м. В квартирах предусмотрены большие французские окна с энергосберегающими стеклопакетами.

Благоустройство придомовой территории

Проект предполагает обустройство зон отдыха, строительство нескольких детских игровых  площадок разной площади, спортивных площадок. Парковка будет организована по периметру комплекса под открытым небом.

Транспортная доступность

Близкое расположение города обеспечивает комфортный и быстрый доступ к жилому комплексу. Дорога до Санкт-Петербурга пролегает по Пулковскому/ Волхонскому шоссе, которые проходят через Пушкин, или по Московскому шоссе через Павловск. Ближайшая станция железной дороги «Антропшино» располагается в 20 минутах езды на рейсовом автобусе. До станций метрополитена «Звездная», «Купчино», «Московская» также курсирует общественный транспорт.

До 2018 года городские власти обещают открыть новую станцию метро «Шушары», которая разгрузит главные транспортные пути.

Инфраструктура

Населенный пункт Коммунар имеет уже сложившуюся инфраструктуру, в которую входят 3 детских сада, 4 общеобразовательные школы, школа искусств и музыкальная школа, поликлиника, отделение почты, спортивный комплекс, супермаркет «Пятерочка», ресторан. Первые этажи жилых домов в комплексе будут отданы под коммерческие помещения.

Качество жизни и безопасность

Во всех квартирах будут подключены центральные коммуникации – водоснабжение, электричество газ, отопление – от собственной газовой котельной, которая будет построена на территории комплекса. В корпусах первой очереди предусмотрен монтаж локального септика, поскольку водоснабжение будет обеспечиваться за счет подключения к местной скважине.

Территория жилого комплекса «Город детства» ограждена и будет находиться под круглосуточной охраной. Во дворах и при въезде будет вестись круглосуточное видеонаблюдение.

Экологичность

В районе Коммунара отсутствуют вредные производства. Вблизи ЖК «Город детства» располагаются крупные зеленые зоны, протекает река Ижора, находятся исторические достопримечательности и дворцово-парковые ансамбли Павловска и Пушкина. Главная изюминка Коммунара – Собор Екатерины Великомученицы.

Целевая аудитория ЖК

Большое внимание застройщик уделил созданию комфортных условий для проживания семей с детьми. Центром комплекса станет детская и спортивная площадки, где малыши с родителями смогут проводить время вместе. Также в поселке Коммунар присутствует большое количество общеобразовательных учреждений.

Мнение эксперта

Для строительства малоэтажного комплекса класса эконом застройщик «СНВ» выбрал отличное место: Коммунар находится недалеко от города, в непосредственной близости располагается Павловск с его развитой культурной, социальной и рекреационной инфраструктурой.

Смущает загруженность автомобильных трасс, ведущих к Северной Столице, однако для жилого комплекса класса эконом это вполне приемлемо.

Инфраструктура представлена многочисленными объектами как на территории жилого комплекса, так и в окружающих микрорайонах. Квартирография также находится на достойном уровне. Динамика строительства идет очень активно: в конце года первые две очереди будут сданы в эксплуатацию.

Застройщик СНВ предлагает следующие способы оплаты квартир в ЖК «Город детства»:

Полную сумму вносит покупатель самостоятельно.

Вся представленная информаци по способам оплаты носит информационный характер и может изменяться. Для получения актуальной информации обращайтесь к специалистам по телефону +7 (812) 409-97-94

ЖК Город детства — цены на сайте от официального застройщика СНВ Северо-Запад, планировки жилого комплекса, ипотека, акции новостройки — Ленинградская область, Гатчинский район, Коммунар, Железнодорожная улица

Расположение, транспортная доступность

Комплекс строится в экологически благоприятном, удаленном от шумных магистралей районе. Сочетание прекрасного расположения с транспортной доступностью делают ЖК хорошим вариантом для покупки квартиры. Напротив комплекса есть несколько автобусных остановок, рядом проходит железная дорога, а до станции «Антропшино» всего два километра по Железнодорожной улице, движение по которой редко бывает затруднено.

До центра Санкт-Петербурга можно доехать за двадцать минут на автомобиле по Киевскому или Московскому шоссе, или за такое же время на электричке. Путь до ближайшего заезда на КАД составит 26 км. Аэропорт Пулково расположен в получасе езды. Район довольно зеленый, качество воздуха находится на хорошем уровне благодаря отсутствию поблизости крупных производств и загруженных дорог.

Инфраструктура

Инфраструктура района очень хорошо развита. Недалеко от комплекса находятся: школы, детские центры и детские сады, школа искусств, спорткомплекс и стадион, бассейн, поликлиника и больница, несколько отделений банков, фермерский рынок. Жители могут совершить покупки в нескольких супермаркетах в пяти минутах от дома, а также в небольших продуктовых магазинах, расположенных напротив комплекса.

Несколько кафе и ресторанов находятся в пределах десяти минут езды, некоторые из них осуществляют доставку еды на дом. От дома можно прогуляться пешком до побережья реки Ижора, отдохнуть на небольшом оборудованном пляже.

Надежность застройщика

Строительная группа «СНВ» была создана в 2001 году и за время работы на рынке строительных услуг заработала репутацию надежного застройщика, стала лидером в сфере строительства коттеджных поселков в Санкт-Петербурге и области.

Помимо жилых домов компания строит детские сады, школы, спортивные сооружения, санатории, а также занимается реставрацией. У предприятия накоплен солидный опыт в строительстве многофункциональных комплексов, включая развитие транспортной инфраструктуры, инженерное оснащение объектов, проведение высокотехнологичных коммуникаций. Компания строит дома с акцентом на создание удобного пространства для семьи, предоставляя покупателям возможность произвести перепланировку и создать собственный проект. Партнеры организации из числа банков и крупных компаний позволяют сделать вывод о ее надежности и стабильном положении на рынке.

Архитектура

В состав ЖК входит семь восьмиэтажных домов, построенных в несколько очередей. Застройщик спроектировал одно-, двух- и трехкомнатные квартиры площадью от 25 до 65 кв. м и потолками высотой 3 м.

Квартиры в комплексе сдаются с черновой отделкой. Застройщик установил металлические входные двери с современными усиленными замками, однокамерные оконные профили с энергосберегающим стеклом, отражающим инфракрасные лучи, что позволяет сохранять в квартире прохладу в жаркую погоду.

В квартирах установлены электрические щитки и двухтарифные счетчики учета расхода электричества. В санузлах и на кухне выполнена разводка труб от стояков, установлены счетчики воды, сделан вывод для подключения стиральной машины. Система отопления включает установку современных радиаторов.

Оформление и оснащение придомовой территории является преимуществом комплекса.

Застройщик грамотно распланировал пространство, выделив место для футбольного поля, организовав детские игровые комплексы и места для спокойного отдыха, спроектировав систему деликатной подсветки домов в темное время суток. На территории оборудован пункт охраны, ведется видеонаблюдение. Для удобства жильцов предусмотрен вместительный паркинг и гостевая наземная автостоянка. Из окон открывается вид на район и зеленый массив.

МЖК «Город Детства», от СНВ в Гатчинском районе ЛО. Официальный сайт и подробная информация.

Проект ЖК «Город Детства» реализует производственно-строительная группа «СНВ». Комплекс находится на Железнодорожной улице города Коммунар Ленинградской области. Квартиры продаются согласно 214 Федеральному закону. Дома планировалось вводить в эксплуатацию в несколько очередей. Сданы только 8 и 9 корпуса (в 2016 и 2017 годах). Сроки сдачи остальных корпусов переносились. На июнь 2018 года строительные работы на объекте не ведутся. 

 

«Город Детства» — это 10 кирпичных домов высотой в 3-8 этажей. Площадь застройки равна 17 Га. При отделке фасадных стен используется штукатурка, которую покрывают краской ярких цветов. В ЖК запроектированы квартиры-студии площадью от 25 до 34 кв. м, однокомнатные квартиры площадью от 32 до 58 кв. м, а также 2-комнатные (площадь 47-62 кв. м) и 3-комнатные (площадь 59 кв. м) квартиры. Согласно проекту, общее количество квартир в комплексе — 630, в каждом корпусе от 56 до 104 жилых помещений. Отделка в квартирах отсутствует. 

 

В ЖК предусмотрены своя охрана, установка системы видеонаблюдения, проведение благоустройства (обустройство площадок для занятий спортом, детских площадок, зон отдыха). Запроектирован подземный и наземный паркинги, автостоянка. 

 

В городе Коммунар есть необходимые объекты социально-бытовой инфраструктуры. Здесь работают банковское и почтовое отделения, кафе, рестораны, магазины, спорткомплекс. Рядом с ЖК, в радиусе 550 метров, находятся три детских сада. Возле объекта, в 150 метрах, расположена школа №2, другие две школы расположены в 1 и 1,5 км от новостройки.  

 

Автобусная остановка расположена в 5 минутах ходьбы от ЖК. До ближайшей станции метро «Купчино» дорога на автобусе займет около 1 ч 20 мин. Также до Купчино можно добраться за 25 минут на электричке, сев на нее на железнодорожной станции Антропшино. Автобус от домов до станции едет 5 минут. 1 час 15 минут идут автобусы до станций метро «Звездная» и «Московская». На автомобиле до Санкт-Петербурга ехать около 35 минут, до Гатчины около — 20-25 минут. Путь до Павловска и Пушкина займет на машине 12 и 25 минут, на автобусе — 20 и 30 минут соответственно. Расстояние от ЖК до КАД составляет 25 километров. 

 

Экология микрорайона благоприятная. Поблизости нет промышленных производств. В 350 метрах от новостройки расположена река Ижора. 

 

ЖК «Город детства» снова строят, а дом в «Радужном» — уже ввели

30 декабря 2020

В Ленинградской области за год введен в эксплуатацию 21 долгострой для 4 тыс. человек.

Началось развертывание строительной площадки проблемного ЖК «Город детства» в Коммунаре. Заказчик строительства — Фонд защиты прав граждан-участников долевого строительства Ленинградской области, он достроит три корпуса проблемного ЖК, дольщики остальных пяти получат компенсации. 

«ЖК «Город детства» — первый проблемный объект, который будет достроен с применением механизмов Фонда: в декабре прошлого года было принято решение о финансировании завершения корпусов 6,7,10 ЖК «Город детства». Раньше достройка проблемных домов могла быть только инвестором с применением схемы ЖСК — это было долго и неудобно», — сказал заместитель председателя правительства региона Михаил Москвин в ходе осмотра площадки. 

В трехэтажных домах «Города детства» по 33 квартиры, все были проданы прежним застройщиком «СНВ Северо-запад». В начале 2020 года три корпуса «Города детства» были переданы региональному Фонду защиты прав дольщиков, сделан проект их завершения. Проект получил положительное решение экспертизы, был выбран подрядчик строительства. 

«По проекту организации строительства, окончание работ в трех корпусах жилого комплекса — сентябрь 2021 года, когда мы будем вручать ключи», — сказал Михаил Москвин.

Также в среду комитет Госстройнадзора выдал разрешение на ввод корпуса 6.6 проблемного ЖК «Радужный» во Всеволожске, где квартир ждет 381 дольщик. Дом завершал донор — компания «Гарантъ» по соглашению с администрацией Ленинградской области. Год назад «Гарантъ» достроил корпус 6.1 ЖК «Радужный», где квартиры получили 287 человек.

В 2019-2020 годах федеральный Фонд подтвердил финансирование достройки следующих комплексов: ЖК «Рябиновый сад», ЖК «Янинский каскад-4», ЖК «Десяткино, 2 очередь», ЖК «Десяткино 2.0», ЖК «Ванино», ЖК «Шотландия», ЖК «Щегловская усадьба», ЖК «Кирккоярви» (3 корпус), ЖК «Yolkki Village», ЖК «Итальянский квартал», ЖК «Аннинский парк». Процесс достройки находится на разных стадиях: от передачи объектов Фонду решением арбитражного суда до получения положительного заключения экспертизы проекта завершения строительства.

ЖК «Город Детства» — Квартиры от 1 800 000 в жилом комплексе от застройщика

Девелопером ЖК «Город Детства» является ПСГ «СНВ». Данная компания на рынке недвижимости СПб с 2001 года и имеет репутацию надежного застройщика, оставаясь лидером в сегменте возведения коттеджных поселков. Данный проект строиться в городе Коммунар, Гатчинского района. 
Транспортная доступность
По Московскому шоссе до кольцевой дороги ехать около 20 км, до ближайшей станции метро добираться около получаса. От комплекса ходят маршрутные такси в различных направлениях. Совсем недалеко проходит железная дорога, где курсируют электрички. Аэропорт Пулково расположен всего в получасе езды от комлекса. 
Экология местности
ЖК «Город Детства» расположен в чистом, благоприятном с экологической точки зрения месте. Совсем рядом расположены зеленые зоны, протекает река Ижора.  Жилые корпуса удалены от шумных магистралей, да и крупных производств по близости нет. Как следствие, качество воздуха тут находится на хорошем уровне
Квартирография
Всего должно быть построено 10 восьмиэтажных кирпичных корпусов. Всего ожидается сдача 630 комфортабельных квартир с высокими потолками. Вы можете выбрать для себя подходящую по размерам и планировке. Есть как студии, так 1-но, 2-х и 3-х комнатные лоты, площади которых варьируются от 25 до 61 кв. м. Передавать квартиры владельцам планируется без отделки. 
Инфраструктура района и благоустройство территории
Для безопасности жильцов, территория ЖК «Город Детства» будет оборудованна видеонаблюдением и системой охраны. В комплексе предусмотрено благоустройство придомовой территории, площадки для отдыха детей и занятий спортом. Для размещения автомобилей планируется возвести крытый паркинг, подземный паркинг и открытые автостоянки.
Комплекс возводится в черте города, где будущих жильцов уже ждет готовая инфраструктура – школы, детские сады, поликлиники, отделения банков и почты.

ЖК Город Детства

Реализуемый яркий проект застройщика СНВ – ЖК «Город детства» новым, по сути, не является. Строительство объекта долгое время откладывалось, зато теперь жилому комплексу точно быть. Концепция проекта – якркие краски на фасадах и такая же яркая прилегающая территория не ставят этот объект в г. Коммунаре незамеченным.

Описание ЖК Город детства

Жилищный комплекс возводится на участке общей площадью 18 га. Проектом предусмотрено строительство 10 монолитных жилых домов – 7 6-этажных и три дома высотой в три этажа. В центре комплекса расположится большая детская площадка и две поменьше — для отдыха и для занятий спортом.
Первыми в продажу выходят три 3-этажных корпуса, их ввод в эксплуатацию запланирован на 4 квартал 2015 года. Следующая очередь будет готовиться к сдаче во 2 квартале 2016 года. Сами квартиры, а сейчас в продаже имеются студии, 1- и 2-комнатные квартиры, имеют продуманные и компактные планировки. Общий метраж их от 25 м2 до 44, 5 м2.
Характерная особенность данного проекта – при всей простоте конструктива и малогабаритности квартир, у застройщика есть своя «фишка» — это французские окна в квартирах – дополнительный источник света в квартирах с небольшим метражом и прекрасное интерьерное решение.
Жильцы комплекса будут получать в квартиры тепло посредством автономной газовой котельной. Канализация – центральная. Во всех жилищах установят окна из металлопластика, регулируемые радиаторы, металлические двери в квартиры.
Название проекта отражает суть: внутри закрытой территории жилищного комплекса будет сделано все для того, чтобы подрастающему поколению было весело и безопасно гулять. Оформление жилых корпусов и площадок будет радовать глаз как ребенка, так и взрослого.

Инфраструктура ЖК Город детства

Коммунар — город небольшой и еще недавно не был востребован, но сейчас, когда Санкт-Петербург растет и развивается, осваиваются прилегающие территории, в том числе и южное направление, застройщики всё чаще рассматривают его как площадку для будущих проектов.
Сейчас же в развивающемся Коммунаре есть всё, что нужно: детские сады, школы, школа искусств, спортивные комплексы, бассейн, магазины и рынки.

Транспортная доступность
Добираться в «Город детства» из Петербурга довольно удобно. Для тех, у кого нет личного авто путь займет не много времени: с Витебского вокзала Санкт-Петербурга до станции Антропшино ходят электрички (путь занимает не более 40 минут), а от самой станции до ЖК можно добраться на автобусе. На тех же автобусах можно добраться прямиком от метро (Купчино, Звездная, Московская). Между городами курсируют маршрутки К-545, К-545А, К-363.
Дорога на личном авто до Павловска занимает не более 10 минут.

Квартиры-студии

S общ S жил S кухн Санузел Балкон Цена за м2 Стоимость Планировка
27,50 18,10 0 Совместный Нет 40 909 руб 1 125 000 руб    

Однокомнатные квартиры

S общ S жил S кухн Санузел Балкон Цена за м2 Стоимость Планировка
25,00 9,70 7,80 Совместный Нет 48 640 руб 1 216 000 руб  
32,50 11,30 11,30 Совместный Нет 43 015 руб 1 398 000 руб

Двухкомнатные квартиры

S общ S жил S кухн Санузел Балкон Цена за м2 Стоимость Планировка
44,20 20,30 11,30 Совместный Нет 41 131 руб 1 818 000 руб

Фотографии

Кооперативам дольщиков «Города Детства» передадут земли и недострои без доплат.

Арбитражный суд Санкт-Петербурга и Ленинградской области принял решение о передаче трёх недостроенных корпусов проблемного жилого комплекса «Город детства» в Коммунаре с земельными участками трём жилищно-строительным кооперативам, созданным в результате банкротства застройщика – компании «СНВ-Северо-Запад».

Кооперативам, созданным участниками строительства 3 и 7 корпусов, будут переданы объекты незавершенного строительства и земельные участки под ними. ЖСК, созданному дольщиками 1 корпуса будет передан только земельный участок (дом так и не начали строить).

Вырученных от эффективной реализации конкурсным управляющим активов, включенных в конкурсную массу ООО «СНВ Северо-Запад», хватило для погашения текущих платежей и задолженности второй очереди. Это позволило передать землю и недострой без доплат со стороны дольщиков.

По остальным пяти корпусам продолжается оформление и постановка на кадастровый учет объектов незавершенного строительства. После получения документов на объекты незавершенного строительства заявления о погашении будут также направлены в Арбитражный суд СПб и Ленинградской области.
Весной этого года дольщики «СНВ Северо-Запад» приняли решение об формировании ЖСК в процедуре банкротства.

Согласно законодательству, на каждый дом возможно образовать один кооператив — итого в данном случае их может быть восемь. Все восемь корпусов подали ходатайства о формировании ЖСК. Текущий план завершения и ввода домов — достройка силами компании «Стоун» и «Лига строй» за компенсационный участок. Также рассматривается возможность входа структур госкомпании Дом.рф в проект достройки.

ЖК «Город Детства» состоит из восьми корпусов в разной степени готовности, где заключено более 400 ДДУ. Решением Арбитражного суда Санкт-Петербурга и Ленинградской области от 25 июня 2018 г. застройщик признан банкротом, открыто конкурсное производство.

Источник: https://vk.com/wall-36475524_583

Гостевой блог IFPRI: Растущие городские районы требуют дополнительных исследований для решения задач развития

Блог

Быстрая урбанизация — одно из самых преобразующих явлений нашего мира. Сегодня более половины населения мира проживает в городах, и по прогнозам к 2050 году две трети населения мира будут урбанизированы, что приведет к увеличению численности городов примерно на 2,5 миллиарда человек.Хотя быструю урбанизацию можно рассматривать как характерную черту экономического роста, особенно в контексте стран с низким и средним уровнем доходов, она не лишена проблем. Растущие размеры городов скрывают их неспособность обеспечить достойную жизнь, здоровье и санитарные условия наиболее уязвимым слоям населения. В рамках этой городской кампании мы рассматриваем некоторые из этих проблем и текущие пределы нашего знания о них. — Мари Рюэль

* Этот блог был первоначально опубликован на сайте блога IFPRI и предоставлен ими для кампании SNV по вопросам городского развития.

Города все чаще становятся домом для хронического недоедания среди детей и стойкого дефицита питательных микроэлементов, а также наблюдается тревожный рост избыточного веса и ожирения, переносящего бремя недоедания с сельских районов, где они традиционно были наиболее распространены, на городские. Почти каждый третий ребенок с задержкой роста — или низким для своего возраста — сейчас живет в городских районах, и эта доля неуклонно растет с середины 1980-х годов.В то же время между 1993 и 2002 годами уровень бедности в городских районах развивающихся стран оставался неизменным, даже несмотря на то, что уровень бедности в сельской местности снизился (более свежие данные о сравнении изменений уровней бедности в городах и сельских районах отсутствуют).

Этот перенос бедности, отсутствия продовольственной безопасности и недоедания из сельских в городские районы требует нового понимания движущих сил этих проблем, а также политики, программ и мероприятий, необходимых для их решения. Но большинство фактических данных и данных о городской бедности и недоедании, которые могут помочь в разработке эффективных вмешательств, либо устарели, либо неполны.Для решения проблем, которые быстро растущие города представляют для городской бедноты, срочно необходимы всесторонние высококачественные исследования, подкрепленные адекватным финансированием.

Перспектива лучшей жизни заставляет большинство людей мигрировать из деревень в города. Но хотя города обычно обеспечивают лучший доступ к здравоохранению, чистой воде, безопасному питанию и надлежащим санитарным услугам, многие из этих льгот недоступны для самых бедных и уязвимых городских жителей.

Нигде проблемы городской бедности не видны более наглядно, чем в трущобах, которые характеризуются перенаселенностью и недостаточным доступом к безопасной воде, санитарии и инфраструктуре.Эти стесненные условия жизни подвергают жителей трущоб, особенно уязвимых детей, множеству рисков для здоровья, связанных с плохой гигиеной и загрязнением воды и продуктов питания. Исследования показали, что случаи диарейных заболеваний, холеры, пневмонии, астмы и недоедания среди детей в трущобах намного выше, чем в среднем в городских районах. Согласно прогнозам, к 2030 году почти 2 миллиарда человек будут жить в трущобах в странах с низким и средним уровнем доходов.

Городская беднота сталкивается с конкретными проблемами, которые требуют индивидуальных решений, основанных на фактических данных и исследованиях. Хотя общеизвестно, что городские бедняки обычно имеют меньший доступ, чем их сельские сверстники, к традиционным неформальным сетям социальной защиты в виде родственников и друзей, недавние исследования показали, что они также отстают в охвате официальными сетями социальной защиты. Опрос 2014 года показал, что в среднем только 21 процент городских жителей охвачены сетями социальной защиты по сравнению с 28 процентами их сверстников в сельской местности.

Бедные жители сельских районов по-прежнему составляют большинство бедняков во всем мире, поэтому это расхождение частично связано с общей нацеленностью программ на бедные слои населения.Но это также подчеркивает общее игнорирование городской бедноты, которая сталкивается с уникальными ограничениями и часто живет преходящей жизнью, что затрудняет их охват с помощью традиционных программ социальной защиты.

Рынок в Дыре-Дауа, Эфиопия

Трущобы Дхарави в Мумбаи, Индия

В этой головоломке не хватает многих частей, и ключевой частью являются исследования и доказательства. Исследования могут помочь нам понять масштабы и ключевые факторы бедности, отсутствия продовольственной безопасности, плохого здоровья и недоедания в городах, и эта информация необходима для разработки соответствующих программ и ответных мер политики. Просто не хватает исследований, чтобы предоставить доказательную базу ограничений, с которыми горожане сталкиваются при удовлетворении всех своих основных потребностей, включая то, что определяет их решения относительно продуктов, которые они покупают, где они делают покупки и как они реагируют на давление с целью уйти от от традиционных диет до употребления ультрапастеризованной пищи и нездорового питания.Остается много безответных вопросов о влиянии глобальной и национальной продовольственных систем и о том, как городская продовольственная среда влияет на доступ к продовольствию и выбор продуктов питания для городской бедноты.

Высококачественные исследования могут помочь дать ответы на многие вопросы, на которые необходимо ответить, чтобы защитить жизнь, здоровье и питание городской бедноты в растущих городах по всему миру. Финансирование таких исследований полностью отсутствует, несмотря на широко распространенное признание того, что переход на нездоровую диету с высоким содержанием насыщенных жиров, добавленного сахара и соли, а также чрезмерное потребление продуктов с высокой степенью переработки распространяется гораздо быстрее в городах, чем в сельской местности. и является движущей силой глобальной эпидемии избыточного веса, ожирения и связанных с ними неинфекционных заболеваний.

Рынок Самраонг, Камбоджа

Рынок в Кабуле, Афганистан

В течение очень долгого времени усилия в области развития были сосредоточены на решении проблем бедности, отсутствия продовольственной безопасности и недоедания в сельских районах, но сейчас мы видим, как аналогичные и новые проблемы быстро переносятся в города во многих регионах. Необходимо срочно понять эти изменяющиеся модели и то, как бедность выглядит и ощущается в городах. Качественные и целенаправленные программы и актуальные для политики исследования жизни в городах могут в конечном итоге помочь обеспечить равное распределение благ, получаемых от городской жизни, в том числе среди наиболее уязвимых. Чтобы это произошло, доноры должны быть частью этих усилий.

Мари Руэль — директор отдела бедности, здоровья и питания IFPRI.

Архивы Университета Невады, Лас-Вегас (UNLV) — Южная Невада Strong

Разработать критерии реализации, в соответствии с которыми будущие коридоры будут определять приоритетность, включая: потенциальное количество пассажиров, потенциал экономического развития / транзитно-ориентированного развития (TOD), близость к рабочим местам, жилью и образованию, повышение качества жизни и интеграция с велосипедной и пешеходной сетью.

Ведущая организация: Региональная транспортная комиссия Южной Невады (RTC)
Поддерживающие организации: Глобальный экономический альянс Лас-Вегаса (LVGEA) ; Местное управление ; Университет Невады, Лас-Вегас (UNLV)
Мероприятия по реализации: Город Лас-Вегас (CLV) ; Региональная транспортная комиссия Южной Невады (RTC) ; Университет Невады, Лас-Вегас (UNLV)

Временные рамки: Краткосрочные

3 Примечания к этой подцели
  • Metropolitan Planning Organization (MPO) -Инжиниринг
    MPO-Planning и Transit Planning возьмут на себя ведущую роль, а MPO-Engineering будет обеспечивать поддержку для реализации этой цели.
  • Metropolitan Planning Organization (MPO) — Планирование
    MPO-Planning разрабатывает интерактивную программу просмотра программы улучшения транспорта (TIP), которая позволит отделу сопоставлять такие данные, как безопасность и загруженность.
  • Планирование транзита
    -Определены и ранжированы 33 маршрута для улучшений, которые будут включены в 10-летний план.
    — Акцент делается на улучшении маршрутов, обеспечивающих экономический смысл, рабочие места и другие преимущества, которые должны быть включены в 10-летний план.

Специалист по закупкам SNV (гражданин Руанды)

ОПИСАНИЕ ПРОЕКТА

Санитарные мероприятия в сельских районах Руанды — Isuku Iwacu — это четырехлетний проект по санитарии в сельских районах (2 сентября 2016 г. — 9 ноября 2020 г.), финансируемый Агентством США по международным делам. Разработка (USAID). Мероприятие осуществляется консорциумом неправительственных организаций во главе с SNV, включая World Vision International и Water for People.Общая цель деятельности Isuku Iwacu состоит в том, чтобы повысить местную ответственность и потенциал для предоставления устойчивых, высококачественных услуг в области санитарии и гигиены, чтобы уменьшить задержку роста у детей. . Isuku Iwacu реализуется в восьми округах: Кайонза, Кикукиро, Нгома, Ньябиху, Ньянза, Ньяругенге, Руханго и Рвамагана. Мероприятие поможет примерно 500 000 человек получить доступ к улучшенным санитарно-техническим средствам в домах, при этом руандийцы из 137 деревень в 8 округах будут жить в условиях, свободных от открытой дефекации (ODF).

РЕЗЮМЕ ПОЛОЖЕНИЯ

SNV в настоящее время ищет специалиста по закупкам для финансируемого USAID проекта Isuku Iwacu. Специалист будет отвечать за закупку разнообразных товаров и услуг для всех микро-, малых и конкурентоспособных закупок Isuku Iwacu по мере необходимости. Это включает, помимо прочего, запрос предложений (RFP), запрос предложений (RFQ), гранты, соглашения с консультантами, общие соглашения о закупках, контракты, заказы на поставку и накладные.

Специалист будет членом управленческой группы Isuku Iwacu, руководить всеми аспектами закупок в соответствии с Политикой закупок SNV и обеспечивать полное соблюдение всех применимых положений Соглашения о сотрудничестве Isuku Iwacu и федеральных правил USG, CFR и ADS.

Эта позиция базируется в Кигали, время от времени совершая поездки в восемь целевых районов.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ И ОБЯЗАННОСТИ

· Подготавливает годовые планы закупок в соответствии с утвержденными планами работы и запланированными мероприятиями для обеспечения своевременных закупок необходимых товаров и услуг.

· Рассматривает все поступающие запросы на закупку, устанавливает приоритеты и выполняет все необходимые приготовления, необходимые в зависимости от типа запрашиваемой закупки.

· Определяет подходящие источники поставок посредством расширенного локального и неместного поиска и запрашивает предложения и расценки по телефону, переписке и рекламе для доступа к широкому кругу государственных организаций.

· Рассматривает и анализирует заявки и предложения и рекомендует наиболее квалифицированного поставщика, учитывая предлагаемые цены и возможности поставщика, репутацию и прошлые результаты.

· Поддерживает связь с командой программы и готовит запросы предложений и запросы предложений, обеспечивая выполнение всех требований (спецификации, объемы работ, критерии оценки и т. Д.).

· Организует и координирует отборочные комиссии для рассмотрения каждой заявки и составляет необходимую документацию (заявки или матрицы оценки, письма BAFO и т. Д.), Обеспечивая полноту и соответствие.

· Участвует в переговорах по контрактам, готовит и проверяет высокое качество и точность каждого пакета контрактов (записки о выборе, ограниченный отбор и другие требования доноров, контракты, соглашения / гранты или заказы на закупку, модификации и т. Д.)) до подачи подписи контрактов или соглашений.

· Поддерживает и согласовывает трекер всех контрактов и соглашений, чтобы записывать результаты, вносить необходимые изменения и / или отмены, а также выполнять соответствующее закрытие.

· Отслеживает счета-фактуры / результаты по контрактам и соглашениям и снижает перерасход средств, включая координацию / связь с соответствующим поставщиком, подрядчиком и отделом оплаты проекта.

· Ведение электронных и печатных копий всех действий по закупкам, а также поддержка анализа и аудита файлы закупок

· Следит за изменениями в контрактных требованиях и сообщает о них.

· Постоянно определяет способы оптимизации процедур и процессов проекта.

· Координирует инвентаризацию проекта.

· Обсуждает и согласовывает квартальные целевые показатели эффективности со своим руководителем.

· Выполняет другие порученные или требуемые задачи.

Управление восприятием не канализационных систем канализации в отношении запланированного вмешательства по изменению поведения при опорожнении фекального ила

  • Альбаррасин Д., Вайер Р.С., младший (2000) Когнитивное влияние прошлого поведения: влияние на убеждения, отношения и будущие поведенческие решения.J Pers Soc Psychol 79 (1): 5–22. https://doi.org/10.1037/0022-3514.79.1.5

    Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Алам М.С., Мондал М. (2019) Оценка качества санитарных услуг в городских трущобах города Кхулна на основе модели SERVQUAL и AHP: тематическое исследование железнодорожных трущоб, Кхулна, Бангладеш. J Urban Manag 8 (1): 20–27. https://doi.org/10.1016/j.jum.2018.08.002

    Статья Google Scholar

  • Ахмед Р., Хассан, С. (2012) Труднодоступные районы: предоставление услуг водоснабжения и канализации для всех.поддержка реформ сектора водоснабжения и санитарии, учитывающих интересы малоимущих. Программа водоснабжения и санитарии: Руководство. http://documents.worldbank.org/curated/en/374301468208781989/pdf/7REPLACEM00India0Guidance0Note.pdf. По состоянию на 07 июля 2018 г.

  • Appiah-Effah E, Nyarko KB, Gyasi SF, Awuah E (2014) Управление фекальным осадком в районах с низким доходом: тематическое исследование трех районов в регионе Ашанти в Гане. Дж. Уотер Санит Хиг Дев 4 (2): 189–199. https://doi.org/10.2166/washdev.2014.126

    Статья Google Scholar

  • Армстронг Д.М. (1961) Восприятие и физический мир. Routledge & Kegan Paul, Лондон, ISBN: 0710036035 196 p

    Google Scholar

  • Arlinghaus KR, Johnston CA (2017) Пропаганда изменения поведения с помощью образования. Am J Lifestyle Med 12 (2) 113–116. https://doi.org/10.1177/1559827617745479. https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6124997/pdf/10.1177_1559827617745479.pdf. Доступ 30 апреля 2020 г.

  • Айзен I (1985) От намерений к действиям: теория запланированного поведения. В: Kuhl J, Beckman, J (eds) Action-control: From Cognition to Behavior. Гейдельберг, Германия, Springer

  • Багери А., Шабанали Фами Х, Резванфар А., Асади А., Яздани С. (2008) Восприятие рисовых фермеров в отношении устойчивых сельскохозяйственных технологий: случай водосборного бассейна Хараз в провинции Мазандаран, Иран.Am J Appl Sci 5 (10): 1384e1391. https://doi.org/10.3844/ajassp.2008.1384.1391

    Статья Google Scholar

  • Баласубраманья С., Эванс Б., Ахмед Р., Хабиб А., Асад НСМ, Рахман М., Хасан М., Дей Д., Камарго-Валеро М., Рао К.С., Фернандо С. (2017). услуги по удалению ила для туалетов с одной ямой. Дж. Уотер Санит Хиг Дев 7 (1): 121–128. https://doi.org/10.2166/washdev.2017.073

    Статья Google Scholar

  • Bandura A (2004) Укрепление здоровья с помощью социальных когнитивных средств.Поведение в области санитарного просвещения 2004 31: 143–164

    Статья Google Scholar

  • Bandura A (2000) Укрепление здоровья с точки зрения социальной когнитивной теории. В: Норман П., Абрахам С., Коннер М. (ред.) В книге «Понимание и изменение поведения в отношении здоровья: от убеждений о здоровье к саморегулированию». Harwood Academic Publishers, Амстердам, стр. 299–339

    Google Scholar

  • Бандура А. (1971) Теория социального обучения.General Learning Press, Нью-Йорк, NY

    Google Scholar

  • Бандура A (1977a) Теория социального обучения. Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ

    Google Scholar

  • Bandura A (1977b) Самоэффективность: к объединяющей теории изменения поведения. Psychol Rev 84: 191–215

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • Барг Дж. А., Чен М., Берроуз Л. (1996b) Автоматичность социального поведения: прямое влияние концепции черт и активации стереотипов на действие.J Pers Soc Psychol 71: 230–244

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • Bargh JA, Chartrand T (1999) Невыносимая автоматичность бытия. Am Psychol 54: 462–479

    Статья Google Scholar

  • Барг Дж. А., Фергюсон М. Дж. (2000) За пределами бихевиоризма: об автоматизме высших психических процессов. Psychol Bull 126: 925–945

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • BBS (Статистическое бюро Бангладеш), (2015) Перепись районов трущоб и плавающего населения, 2014 г.Предварительный отчет об исследовании, Статистический и информационный отдел, Министерство планирования, Правительство Народной Республики Бангладеш (2015). http://www.bbs.gov.bd/WebTestApplication/userfiles/Image/Slum/Preli_Slum_Census.pdf. Доступ 21 апреля 2020 г.

  • Becker MH (ed) (1974) Модель убеждений в отношении здоровья и поведение в отношении личного здоровья. Чарльз Б. Слэк, Торофар, Нью-Джерси

    Google Scholar

  • Бернард Х.Р. (2002) Методы исследования в антропологии: качественные и количественные методы, 3-е изд.AltaMira Press, Уолнат-Крик, Калифорния

    Google Scholar

  • Берковиц Л. (1984) Некоторые эффекты мыслей на анти- и просоциальные влияния медиа-событий: когнитивно-неоассоциативный анализ. Psychol Bull 95: 410–427

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • Бок Дж. К. (1986) Синтаксическая устойчивость в языковом производстве. Cogn Psychol 18: 355–387

    Статья Google Scholar

  • BNBC (2014) Национальный строительный кодекс Бангладеш. Министерство жилищного строительства, Бангладеш

    Google Scholar

  • Бок Дж. К. (1989) Имманентность закрытого класса в производстве предложений. Познание 31: 163–186. 32

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • Bornstein MH (2013) Настройка матери и ребенка: многоуровневый подход через тело, мозг и поведение. В: Legerstee M, Haley DW, Bornstein, MH (ред.), Младенческий разум: истоки социального мозга.Guilford Press. стр. 266–298

  • Брешиани К., Колорни А., Лия Ф., Луэ А., Ночерино Р. (2016) Изменение поведения и социальные инновации через вознаграждение: интегрированная система взаимодействия для личной мобильности, городской логистики и повышения эффективности жилищного строительства. Транспортные процедуры Res 14: 353–361. https://doi.org/10.1016/j.trpro.2016.05.087

    Статья Google Scholar

  • Брюер В. Ф., Ламберт Б.Л. (2001) Теоретическая нагрузка на наблюдение и теоретическая нагрузка на остальной научный процесс.Philos Sci 3: 176–18610.1086 / 3

    Статья Google Scholar

  • Брунер Дж. С. (1957) О готовности к восприятию. Psychol Rev 64 (2): 123–152. https://doi.org/10.1037/h0043805

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • Cabıoğlu MT, İşeri SÖ (2015) Методологический подход в управлении восприятием. Журнал библиотеки открытого доступа, 2: e1699. https: // doi.org / 10.4236 / oalib.1101699. https://www.researchgate.net/publication/282465933_Methodological_Approach_in_Perception_Management. По состоянию на 29 апреля 2020 г.

  • Cañal-Bruland R, Van Der Kamp J (2009) Цели действий влияют на восприятие конкретных действий. Psychonom Bull Rev 16 (6): 1100–1105. https://doi.org/10.3758/PBR.16.6.1100

    Статья Google Scholar

  • Cairns-Smith S, Hill H, Nazarenke E (2014) Городская санитария: зачем нужен портфель; бостонская консалтинговая группа: Бостон, Массачусетс, США, 2014. Доступно в Интернете: http://www.bcg.com/documents/file178928.pdf. По состоянию на 23 мая 2016 г.

  • Carver CS, Scheier MF (1981) Внимание и саморегулирование: подход к человеческому поведению на основе теории контроля. SpringerVerlag, New York, NY

    Забронировать Google Scholar

  • Шарко Дж. М. (1886) Neue Vorlesungen Uber die Krankhetten des Nervensystems (Autorisierte Deutsche Ausgabe von S. Freud). Toeplitz & Deuticke, Лейпциг, Германия

    Google Scholar

  • Chartrand T, Bargh J (1999) Эффект хамелеона: связь между восприятием и поведением и социальное взаимодействие.J Pers Soc Psychol 76 (6): 893–910

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • Chemero A (2003) Информация для восприятия и обработки информации. Мыслительные машины 13: 577–588. https://doi.org/10.1023/A:102620

    08. pdf

    Статья Google Scholar

  • Чоудри С., Коне Д. (2012) Бизнес-анализ управления фекальным осадком: услуги по опорожнению и транспортировке в Африке и Азии — проект окончательного отчета.Фонд Билла и Мелинды Гейтс, Сиэтл, США. https://www.susana.org/_resources/documents/default/2-1662-chowdhury-2012-business.pdf. По состоянию на 04 мая 2020 г.

  • Clasen TFBK, Schmidt WP, Boisson S, Fung IC, Jenkins MW, Scott B, Sugden S и Cairncross S (2010) Вмешательства по улучшению удаления человеческих экскрементов для предотвращения диареи. Кокрановская база данных Syst Rev, CD007180-6.

  • Cochran WG (1977) Методы отбора проб, 3-е изд. Серия Уайли по вероятности и статистике, Великобритания, стр. 448.ISBN: 978-0-471-16240-7

    MATH Google Scholar

  • Creswell JW (2009) Дизайн исследования: качественные, количественные и смешанные методы, 2-е изд. Sage Publications Inc, Таузенд-Оукс, Калифорния

    Google Scholar

  • Cookey PE, Darnswasdi R, Ratanachai C (2016) Восприятие местным населением эффективности управления водными ресурсами в бассейне озера в Таиланде. Манаг «Побережье океана» 120: 11–28.https://doi.org/10.1016/j.ocecoaman.2015.11.015

    Статья Google Scholar

  • Creswell JW, Vicki L, Clark P (2011) Разработка и проведение исследований смешанными методами, 2-е изд. Sage, Thousand Oaks, CA, p 201. ISBN: 1412975174

    Google Scholar

  • Curtis VA, Danquah LO, Aunger RV (2009) Запланированное, мотивированное и привычное гигиеническое поведение: обзор по одиннадцати странам.Health Education Res 24 (4): 655–673

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • Curtis V, Schmidt W, Luby S, Florez R, Touré O, Biran A (2011) Гигиена: новые надежды, новые горизонты. Lancet Infect Dis 11 (4): 312–321

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • Дэниел Д., Маркс С.Дж., Панде С., Ритвельд Л. (2018) Социально-экологические факторы устойчивого внедрения системы очистки воды в домашних условиях в развивающихся странах.NPJ Чистая вода 1:12. https://doi.org/10.1038/s41545-018-0012-z

    Статья Google Scholar

  • Дэниел У. В., Cross CL (2018) Биостатистика: основа для анализа в науках о здоровье, 11-е изд. Серия Уайли по вероятности и статистике. Уайли, Нью-Йорк, ISBN: 978-1-119-49657-1

    MATH Google Scholar

  • Дарнтон А. (2008) Практическое руководство: обзор моделей изменения поведения и их использования.ISBN 978-1-84532-488-9. https://research.fit.edu/media/site-specific/researchfitedu/coast-climate-adaptation-library/climate-communications/messaging-climate-change/Darnton. -2008.-Behaviour-Change-Models-Uses. pdf. По состоянию на 24 апреля 2020 г.

  • Dell GS (1986) Распространяющаяся теория активации поиска в производстве предложений. Psychol Rev 93: 283–321

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • Девайн Дж. (2010) За рамками смесителей: роль вспомогательных продуктов в расширении масштабов и поддержании мытья рук.Ватерлинии 29 (4): 304

    Статья Google Scholar

  • Devine J (2009) Представляем SaniFOAM: основу для анализа поведения в области санитарии для разработки эффективных программ в области санитарии. Всемирный банк, Программа водоснабжения и санитарии, Вашингтон, округ Колумбия, рабочий документ; 22

    Google Scholar

  • DiClemente CC, Marinilli AS, Singh M, Bellino LE (2001) Am J Health Behav 25 (3): 217–27.https://doi.org/10.5993/AJHB.25. 3.8. https://www.researchgate.net/publication/12012814_The_Role_of_Feedback_in_the_Process_of_Health_Behavior_Change. Доступ 30 апреля 2020 г.

  • Dijksterhuis A, van Knippenberg A (1998) Связь между восприятием и поведением, или как выиграть в игре Trivial Pursuit. J Pers Soc Psychol 74 (4): 865–877. https://doi.org/10.1037/0022-3514.74.4.865

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • Dodane PH, Mbeguere M, Sow O, Strande L (2012) Капитальные и операционные затраты на полномасштабные системы удаления фекального осадка и очистки сточных вод в Дакаре, Сенегал.Environ Sci Technol 46: 3705–3711

    ADS CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • Dreibelbis R, Winch PJ, Leontsini E, Hulland KRS, Ram PK, Unicomb L, Luby SP (2013) Интегрированная поведенческая модель для воды, санитарии и гигиены: систематический обзор поведенческих моделей и основы для проектирования и оценка вмешательств по изменению поведения в условиях ограниченной инфраструктуры. BMC Public Health 13.https://doi.org/10.1186/1471-2458-13-1015

  • Игли А.Х., Чайкен С. (1993) Психология отношений. Harcourt Brace, Сан-Диего, CA

    Google Scholar

  • Илес К. (2005) Опорожнение ямы из темноты: сравнение подходов в Дурбане, Южная Африка, и Кибере, Кения. Серия партнерств по санитарии. https://www.ircwash.org/sites/default/files/Eales-2005-Bringing.pdf. По состоянию на 03 мая 2020 г.

  • Eawag / Sandec (2015) SFD Report Khulna, Bangladesh.https://www.eawag.ch/fileadmin/Domain1/Abteilungen/sandec/publikationen/EWM/SFD/SFD_Sandec_Khulna.pdf. По состоянию на 21 апреля 2020 г.

  • EHP, UNICEF / WES, USAID, Всемирный банк / WSP и WSSCC (2004) Рамки улучшения гигиены: комплексный подход к профилактике диареи у детей. Проект по гигиене окружающей среды, Вашингтон, округ Колумбия

    Google Scholar

  • Eidelberg L (1929) Experimenteller Beitrag zum Mechanismus der Imitationsbewegung. Jahresbucher fur Psychiatric und Neurologic 46: 170–173

    Google Scholar

  • Etikan I, Musa SA, Alkassim RS (2016) Сравнение удобной и целевой выборки. J Am J Theor Appl Stat 5: 1–4. https://doi.org/10.11648/j.ajtas.20160501.11

    Статья Google Scholar

  • Фергюсон MJ, Bargh JA (2004) Как социальное восприятие может автоматически влиять на поведение.Trend Cognit Sci 8 (1): 33–39. https://doi.org/10.1016/j.tics.2003.11.004

    Статья Google Scholar

  • Фигероа М.Э., Кинкейд Д.Л. (2010) Социальные, культурные и поведенческие корреляты очистки и хранения воды в домашних условиях. В публикации Центра HCI 2010-1: Информация о коммуникациях в области здравоохранения. Школа общественного здравоохранения Bloomberg Джонса Хопкинса, Центр коммуникационных программ, Балтимор. http://ccp.jhu.edu/wp-content/uploads/Household-Water-Treatment-and-Storage-2010. pdf. По состоянию на 03 мая 2020 г.

  • Fishbein M, Ajzen I (1975) Вера, отношение, намерение и поведение: введение в теорию и исследования. Эддисон-Уэсли, Ридинг, Массачусетс

    Google Scholar

  • Firestone C, Scholl BJ (2015) Можете ли вы испытать нисходящие эффекты на восприятие? Случай категорий расы и воспринимаемой легкости. Психон Булл Ред. 22: 694–700

    PubMed Статья Google Scholar

  • Fodor JA (1983) Модульность разума: эссе по факультетской психологии.MIT Press, Cambridge

    Книга Google Scholar

  • Funk DC, James J (2001) Модель психологического континуума: концептуальная основа для понимания психологической связи человека со спортом. Sport Manag Rev 4: 119–150

    Артикул Google Scholar

  • Funk DC, James J (2006) Значение потребительской лояльности: роль привязанности в развитии от влечения к преданности спортивной команде. J Sport Manag 20: 189–217

    Статья Google Scholar

  • Fuster JM, Bressler SL (2015) Прошлое делает будущее: роль pFC в прогнозировании. J Cogn Neurosci 27 (4): 639–54. https://doi.org/10.1162/jocn_a_00746. Epub 2014 Oct 16

    Статья PubMed Google Scholar

  • Gill L, Mahon JM, Knappe J, Gharbia S, Pilla F (2016) Скорость и механизмы удаления шлама из систем очистки бытовых сточных вод в Ирландии.Агентство по охране окружающей среды, Уэксфорд, http://www.epa.ie/pubs/reports/research/water/Research_Report_253.pdf. По состоянию на 03 мая 2020 г.

  • Grant R (2002) Этика стимулов: историческое происхождение и современное понимание. Econ Philos 18: 111–39

    Статья Google Scholar

  • Grizzell J (2007) Теории и модели изменения поведения. https://www.cpp.edu/~jvgrizzell/best_practices/bctheory. html. Доступ 24 апреля 2020 г.

  • Gollwitzer PM, Sheeran P (2006) Намерения реализации и достижение цели: метаанализ эффектов и процессов.Adv Exp Soc Psychol 38: 249–268

    Google Scholar

  • Harper J, Bielefeldt A, Javernick-Will A, Veasna T (2018) Намерения по управлению фекальным осадком в сельских развивающихся сообществах. Документ, представленный на конференции по организации инженерных проектов: Бриони, Хорватия https://www.researchgate.net/publication/326607793_Intentions_Toward_Fecal_Sludge_Management_in_Rural_Developing_Communities. По состоянию на 17 октября 2018 г.

  • Hashimoto K (2019) Институциональные механизмы устойчивой санитарии: уроки Японии для других азиатских стран.Рабочий документ ADBI 1001. Институт Азиатского банка развития, Токио

    Google Scholar

  • Hochbaum G (1958) Участие общественности в программах медицинского обследования: социально-психологическое исследование. (Публикация службы общественного здравоохранения № 572). Правительственная типография, Вашингтон, округ Колумбия

    Google Scholar

  • Холлингворт К., Баркер Л. (2017) Как использовать поведенческую науку для формирования новых привычек.Источник: WARC Best Practice, июнь 2017 г. https://www.thebearchitects.com/assets/uploads/TBA_Warc_How_to_use_behavioural_science_to_build_habits.pdf. По состоянию на 19 апреля 2020 г.

  • Hong C, Lin M, Sun P, Yang H (2018) Структура зарождающихся и инновационных идей и случайных открытий ранних последователей. Журнал Инф Телеком 2 (1): 19–32. https://doi.org/10.1080/24751839.2017.1359754

    Статья Google Scholar

  • ISF-UTS и SNV (2019) Услуги по опорожнению по расписанию как точка входа для изменений.SNV, Гаага, https://snv.org/cms/sites/default/files/explore/download/2019-scheduled-emptying-services-entrypoint-change-ushhd-paper_0. pdf. По состоянию на 21 апреля 2020 г.

  • Islam S (2016) «Исследование управления фекальным осадком в трех муниципалитетах Бангладеш». Магистерская диссертация. Khulna University of Engineering and Technology (KUET), Бангладеш

  • Джеймс В. (1890) Принципы психологии. Генри Холт

  • Jenkins MW, Cumming O, Cairncross S (2015) Поведение при опорожнении туалетов и спрос на санитарные услуги в Дар-эс-Саламе, Танзания.Int J Environ Res Public Health 12: 2588–2611

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • Дженкинс М.В., Скотт Б. (2007) Поведенческие индикаторы принятия решений домашним хозяйством и спроса на санитарию и потенциальные выгоды от социального маркетинга в Гане. Soc Sci Med 64 (12): 2427–2442

    PubMed Статья Google Scholar

  • Джордан В., Джордан Дж. (1989) Человек в контексте, 2-е изд. Lexicon, Isando, Йоханнесбург

    Google Scholar

  • Кабир А., Салахуддин, М. (2014) Базовое исследование для оценки удаления фекального осадка в жилых помещениях в выбранных южных городах Бангладеш. https://snv.org/cms/sites/default/files/explore/download/snv_-_baseline_study_to_assess_fsm_of_residential_premises.pdf. Доступ 20 апреля 2020 г.

  • Kengne IM, Soh Kengne E, Amougou AK, Bemmo N, Dodane P-H, Koné D (2011) Водно-болотные угодья с вертикальным потоком как новое решение для обезвоживания фекального осадка в развивающихся странах.J Water Sanitation Hyg Dev 1 (1): 13–19

    Статья Google Scholar

  • Кирш К., Хаммерсли-Мэзер, Р. (2017) После заполнения ямы: понимание опорожнения уборной в Форт-Дофин, Мадагаскар. Университет Лафборо. Вклад конференции. https://hdl.handle.net/2134/31493. https://repository.lboro.ac.uk/articles/After_the_pit_is_full_understanding_latrine_emptying_in_Fort_Dauphin_Madagascar/86. По состоянию на 02 мая 2020 г.

  • Koffka K (1925) Die Grundlagen der mentalischen Entwicklung.Остервик, Германия, Цикфельдт

    Google Scholar

  • Koottatep T, Cookey PE, Polprasert C (2019) Регенеративная санитария: основа для санитарии 4.0. Издательство IWA, Гаага, Нидерланды, https://www.iwapublishing.com/books/9781780409672/regenerative-sanitation-new-paradigm-sanitation-40. По состоянию на 19 апреля 2020 г. ISBN13: 9781780409672

  • Kugedera Z (2019) Факторы, определяющие своевременное и безопасное удаление шлама на местах в Кхулне, Бангладеш.Магистр наук в области санитарии. Диссертация выполнена при частичном выполнении требований для получения степени магистра наук в Институте образования в области водных ресурсов ООН-ИГЕ, Делфт, Нидерланды. https://www.researchgate.net/project/Determinants-of-timely-and-safe-on-site-sanitation-systems-desludging-in-Khulna-Bangladesh. Доступ 21 апреля 2020 г.

  • Льюис А. (2001) Проблема восприятия: некоторые образовательные последствия. Идентификатор корпуса: 51734891. https://pdfs.semanticscholar.org/8b13/d8fad80dccf749

    5c537c9a610cd1673.pdf? _ga = 2.

  • 811.1778975802.1588437466-296416183.1583163380. По состоянию на 02 мая 2020 г.

  • Лиска А.Е. (1984) Критическое исследование причинной структуры модели отношения-поведения Фишбейна / Айзена. Soc Psychol Quart 47: 61–74

    Статья Google Scholar

  • Loritoa CD, Pollock K, Harwood R, das Nair R, Logan P, Goldberg S, Booth V, Vedhara K, Van Der Wardt V (2019) Обзорный обзор теорий изменения поведения у взрослых без деменции для адаптации и разработать «PHYT при деменции» — модель, способствующую физической активности людей с деменцией.Maturitas 121: 101–113. https://doi.org/10.1016/j.maturitas.2019.01.008

    Статья Google Scholar

  • Луома-ахо В. , Пирттимяки Т., Мэйти Д., Муннукка Дж., Рейникайнен Х. (2019) Подчеркнутая аутентичность: как прайминг влияет на восприятие аутентичности влиятельными лицами в социальных сетях. Int J Strateg Commun 13 (4): 352–365. https://doi.org/10.1080/1553118X.2019.1617716

    Статья Google Scholar

  • Marteau TM, Ashcroft RE, Оливер A (2009) Использование финансовых стимулов для достижения здорового поведения.BMJ 338: b1415

    PubMed Статья Google Scholar

  • Mara D (1996) Недорогая городская санитария. Джон Вили, Чичестер, p240, https://www.wiley.com/en-us/Low+Cost+Urban+Sanitation-p-9780471

    5 ISBN: 978-0-471-

    -5. Доступ 22 апреля 2020 г.

  • Mansour G, Islam W, Akhtaruzzaman, M (2017) Анализ ситуации в секторе городской санитарии в Бангладеш. Вода и канализация для городской бедноты. https: // www.wsup.com/content/uploads/2017/09/Situation-analysis-of-the-urban-sanitation-sector-in-Bangladesh. pdf. Доступ 21 апреля 2020 г.

  • Mehta M, Mehta D, Yadav U (2019) Общегородская инклюзивная санитария посредством плановых услуг по удалению шлама: новый опыт Индии. Front Environ Sci https://doi.org/10.3389/fenvs.2019.00188

  • Мишель В. (1973) К переосмыслению когнитивного социального обучения личности. Psychol Rev 80: 252–283

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • Мишель А (2019) Познание и восприятие: действительно ли существует различие? Эта статья частично основана на симпозиуме по интегративной науке на Международной конвенции психологических наук (ICPS) 2019 в Париже.Узнайте о ICPS 2021 в Брюсселе. https://www.psychologicalscience.org/observer/cognition-and-perception-is-there-really-a-distinction. По состоянию на 20 апреля 2020 г.

  • Mills F (2013) Оценка накопления ила и скорости заполнения карьера в Индонезии. ПОБВ Всемирного банка, Восточная Азия

    Google Scholar

  • Mills F, Blackett IC, Tayler K, (2019) Оценка систем на месте и скорости накопления шлама для понимания процесса опорожнения карьера в Индонезии. фигшер. https://hdl.handle.net/2134/31078. https://repository.lboro.ac.uk/articles/Assessing_on-site_systems_and_sludge_accumulation_rates_to_understand_pit_emptying_in_Indonesia/95. По состоянию на 03 мая 2020 г.

  • MoLGRD & C (Министерство местного самоуправления по развитию сельских районов и кооперативов) (2017) Институциональная и нормативная база для управления фекальным осадком (IRF-FSM). Правительство Народной Республики Бангладеш. https://ocw.un-ihe.org/pluginfile.php/4172/mod_resource/content/1/FSM%20Framework-Mega%20City%20Dhaka.pdf. Доступ 22 апреля 2020 г.

  • Montangero A (2004) Анализ материальных потоков как инструмент планирования санитарии окружающей среды в развивающихся странах. НЦКИ Север-Юг к.э.н. Тезисное предложение в EAWAG / SANDEC, Цюрих. https://www.dora.lib4ri.ch/eawag/islandora/object/eawag%3A12497/datastream/PDF/Montangero-2006-Material_flow_analysis_for_environmental-%28published_version%29.pdf. Доступ 22 апреля 2020 г.

  • Mosler HJ (2012) Системный подход к вмешательствам по изменению поведения в секторе водоснабжения и санитарии в развивающихся странах: концептуальная модель, обзор и руководство.Int J Environ Health Res 22: 431–449. https://doi.org/10.1080/023.2011.650156

    Статья PubMed Google Scholar

  • Mondal S, Moniruzzaman S, Islam MS (2018) Исследование по опорожнению фекального осадка в отдельных районах города Хулна. J Eng Sc 9 (1): 77–84. https://www2.kuet.ac.bd/JES/images/files/v91/9_JES_165.pdf ISSN 2075-4914. По состоянию на 22 апреля 2020 г.

  • Mondal S (2018) Обработка фекального осадка в городе Кхулна: подход к безопасному опорожнению.защитил кандидатскую диссертацию в области гражданского строительства на факультете гражданского строительства Университета инженерии и технологий Кхулна, Кхулна, Бангладеш. http://dspace.kuet.ac.bd/bitstream/handle/20.500.12228/96/Full%20Thesis. pdf?sequence=1&isAllowed=y. Доступ 21 апреля 2020 г.

  • Моррис Дж., Марцано М., Денди Н., О’Брайен Л. (2012) Исследование лесов: лесное хозяйство, устойчивое поведение и изменение поведения: теории и модели поведения и изменения поведения. https: //www.changewildlifeconsumers.org / site / assets / files / 1369 / behavior_review_theory.pdf. По состоянию на 24 апреля 2020 г.

  • Munro S, Lewin SA, Swart T, Volmink J (2007) Обзор теорий поведения в отношении здоровья: насколько они полезны для разработки вмешательств, способствующих долгосрочному соблюдению режима лечения туберкулезом и ВИЧ / СПИДом? BMC Public Health 7: 104. https://doi.org/10.1186/1471-2458-7-104

    Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Малдер Г. (1979) Восприятие как обработка информации.Urban Ecol 4: 103–118

    Статья Google Scholar

  • Мурунги К. , Питер ван Дейк М. (2014) Опорожнение, транспортировка и удаление фекального ила в неформальных поселениях Кампалы Уганда: экономика санитарии. Habit Internat 42: 69–75. https://doi.org/10.1016/j.habitatint.2013.10.011

    Статья Google Scholar

  • Nakagiri A, Niwagaba CB, Nyenje PM, Kulabako RN, Tumuhairwe JB, Kansiime F (2016) Работают ли уборные с выгребной ямой в городских районах Африки к югу от Сахары? Обзор использования, наполнения, насекомых и неприятных запахов.BMC Public Health 16: 120. https://doi.org/10.1186/s12889-016-2772-z. 2015

    Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Navarro RG (1994) Улучшение санитарии в прибрежных общинах с особым упором на Пуэрто-Принцеса, провинция Палаван, Филиппины. Кандидатская диссертация, Университет Макгилла, Монреаль, Канада. http://www.bvsde.paho.org/texcom/cd050999/navarro.pdf. По состоянию на 07 августа 2018 г.

  • Neil SC, Melanie AF, Helen H, Eithne H (2016) Применение теорий поведения и изменений в отношении здоровья слуха: время для нового подхода.Int J Audiol 55 (sup3): S99 – S104. https://doi.org/10.3109/149.2016.1161851

    Статья Google Scholar

  • Новотны Э., Карр З., Фрэнк М.Г., Дитрих С.Б., Шеддок Т., Кардвелл М., Декер А. (2018) Как люди на самом деле подозревают и обнаруживают ложь. J Невербальное поведение 42: 41–52. https://doi.org/10.1007/s10919-017-0263-2

    Статья Google Scholar

  • Opel A 2012 г. Отсутствие системы удаления фекального осадка подрывает успехи в улучшении санитарно-гигиенических условий в Бангладеш.Устойчивая практика санитарии. https://www.ircwash.org/resources/absence-faecal-sludge-management-shatters-gains-improved-sanitation-coverage-bangladesh. По состоянию на 21 апреля 2020 г.

  • Opel A, Bashar MK, Ahmed MF (2012). Управление фекальным осадком в Бангладеш: проблема, требующая неотложного внимания. Азиатский региональный семинар для практиков в области санитарии и гигиены. https://www.susana.org/_resources/documents/default/2-1674-opel-fsm.pdf. Доступ 21 апреля 2020 г.

  • Park CW, Gardner MP, Thukral VK (1988) Самовоспринимаемое знание: некоторые эффекты на обработку информации для задачи выбора.Am J Psychol, 101 (3) 401–424, https://www.jstor.org/stable/1423087. Доступ 20 апреля 2020 г.

  • Паркинсон Дж., Квадер М. (2008 г.) Проблема обслуживания санитарии на местах в густонаселенных городских районах: опыт пилотного проекта в Дакке. Ватерлинии 27 (2) 149–163. https://www.jstor.org/stable/pdf/24685044.pdf?refreqid=excelsior%3Ae9e6ca649c4f91eac92b4668558f40a7. По состоянию на 04 мая 2020 г.

  • Peal A, Evans B, Blackett I, Hawkins P, Heymans C (2014) Управление фекальными осадками: сравнительная оценка 12 городов.J Water Sanit Hyg Dev 4 (4): 563–575

    Статья Google Scholar

  • Piaget J (1946) Информация о символах Venfant. Delachaux & Niestle, Париж

    Google Scholar

  • Prasad CSS, Ray I (2019) Когда ямы заполняются: (не) видимые потоки отходов в городах Индии. Дж. Уотер Санит Хиг Дев 9 (2): 338–347. https://doi.org/10.2166/washdev.2019.153

    Статья Google Scholar

  • Prinz W (1990) Общий подход к кодированию восприятия и действия.В: Neumann O, Prinz W (ред.) Отношения между восприятием и действием. Springer-Verlag, Берлин, Германия, стр. 167–201

    Chapter Google Scholar

  • Рейни Р.К., Хардинг А.К. (2005) Приемлемость солнечной дезинфекции для очистки питьевой воды в долине Катманду, Непал. Int J Environ Health Res 15 (5): 361–372

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • Repon AC, Faruq O, Mamtaz R (2015) Рекомендации по безопасности и гигиене труда при обращении с фекальным осадком. SNV Нидерландская организация развития, Нидерланды

    Google Scholar

  • Рескорла Р.А. (1987) Павловский анализ целенаправленного поведения. Am Psychol 42 (2): 119–129

    Статья Google Scholar

  • Роджерс Э.М. (2015) Эволюция: распространение инноваций. В: Международная энциклопедия социальных и поведенческих наук (2-е изд.). https://doi.org/10.1016 / B978-0-08-097086-8.81064-8. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780080970868810648. По состоянию на 30 апреля 2020 г.

  • Rogers EM (2003) Распространение инноваций. Free Press, New York, NY

    Google Scholar

  • Розеншток И.М. (1966) Почему люди пользуются услугами здравоохранения. Milbank Quart 44: 94–124

    Статья Google Scholar

  • Rosenquist LED (2005) Психосоциальный анализ взаимосвязи человека и санитарии. J Environ Psychol 25: 335–346. https://doi.org/10.1016/j.jenvp.2005.07.003

    Статья Google Scholar

  • Росс И., Скотт Р., Равикумар Дж. (2016a) Управление фекальными осадками: диагностика для оказания услуг в городских районах. WSP, Группа Всемирного банка, Вашингтон, округ Колумбия, США

    Google Scholar

  • Ross I, Scott RE, Xavier, JR (2016b) Управление фекальными осадками: диагностика для оказания услуг в городских районах — тематическое исследование в Дакке, Бангладеш

  • Roy TK (2014) Устойчивые варианты проектов санитарии в трущобы города Хулна.Равенство в городе: сделать города социально сплоченными, Всемирный день градостроительства 2014 г. https://www.bip.org.bd/SharingFiles/journal_book/20141118150912.pdf. По состоянию на 21 апреля 2020 г.

  • Saxena DP (1971) Концепция «контрольной группы». Soc Sci 46 (3): 155–164

    Google Scholar

  • Шарма М. , Ромас Дж. А. (2012) Теоретические основы санитарного просвещения и укрепления здоровья. Jones and Bartlett Learning, Лондон

    Google Scholar

  • Шенк Р.К., Абельсон Р.П. (1977) Сценарии, планы, цели и понимание.Эрлбаум, Хиллсдейл, Нью-Джерси

    MATH Google Scholar

  • Scherer KR, Walbott HG (1994) Доказательства универсальности и культурных различий в формировании паттернов дифференциальных эмоциональных реакций. J Pers Soc Psychol 66: 310–328

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • Schoebitz L, Bischoff F, Lohri CR, Niwagaba CB, Siber R, Strande L (2017) Анализ ГИС и оптимизация логистики фекального осадка в масштабах города в Кампале, Уганда.Устойчивость 9: 194. https://doi.org/10.3390/su

  • 94

    Статья Google Scholar

  • Schwarzer R (2008) Моделирование изменения поведения, связанного со здоровьем: как прогнозировать и изменять принятие и поддержание поведения, связанного со здоровьем. Appl Psychol: Int Rev 57 (1): 1-29

    Статья Google Scholar

  • Seimetz E, Boyayo A, Mosler H (2016) Влияние контекстных и психосоциальных факторов на мытье рук.Am J Trop Med Hyg, 94 (6), 1407–1417. https://doi.org/10.4269/ajtmh.15-0657. http://www.ajtmh.org/docserver/fulltext/14761645/94/6/1407.pdf?expires=1588557371&id=id&accname=guest&checksum=DB49C25188AA6E73C77BD295B523A644. По состоянию на 04 мая 2020 г.

  • Скиннер Б.Ф. (1953) Наука и поведение человека. Макмиллан, Нью-Йорк, NY

    Google Scholar

  • Strande L, Schoebitz L, Bischoff F, Ddiba D, Okello F, Englund M, Warda BJ, Niwagaba CB (2018) Методы надежной оценки количества и качества фекального осадка для разработки технологий обработки и решений по управлению.J Environ Manag 223: 898–907. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2018.06.100

    CAS Статья Google Scholar

  • Странде Л. , Ронтелтап М., Брджанович Д. (2014) Управление фекальным осадком — системный подход к внедрению и эксплуатации. IWA Publishing, Лондон, Великобритания

    Книга Google Scholar

  • Strauss M, Montangero A, (2002) «Управление ПФ: обзор практик, проблем и инициатив.Лондон и Дюбендорф, проект DFID. https://www.ircwash.org/sites/default/files/Strauss-2002-FS.pdf. По состоянию на 22 апреля 2020 г.

  • SNV (2014) Базовое исследование для оценки удаления фекального осадка в жилых помещениях в выбранных южных городах Бангладеш. https://snv.org/cms/sites/default/files/explore/download/snv_-_baseline_study_to_assess_fsm_of_residential_premises.pdf. По состоянию на 21 апреля 2020 г.

  • Судман С., Брэдберн Н. (2004) Задавая вопросы: полное руководство по составлению анкеты — для маркетинговых исследований, политических опросов, социальных опросов и опросов по вопросам здоровья, 2-е, пересмотренное издание. Джосси Басс, Сан-Франциско, ISBN: 978-0-787-97088-8

    Google Scholar

  • Sydhagen PB (2017) Как отличить восприятие от познания? гипотеза перцептивной адаптации. Диссертация на соискание степени магистра философии. Департамент философии, классики, истории искусства и идей Университета Осло. https://www.duo.uio.no/bitstream/handle/10852/58422/Sydhagen.pdf?sequence=1&isAllowed=y. Доступ 20 апреля 2020 г.

  • Tacca MC (2011) Общие черты восприятия и познания.Фронт Психол 2: 358. https://doi.org/10.3389/fpsyg.2011.00358. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3227022/. Доступ 20 апреля 2020 г.

  • Tankard ME, Paluck EL (2016) Восприятие нормы как средство социальных изменений. Политика социальных вопросов Ред. 10 (1): 181–211. https://static1.squarespace.com/static/5186d08fe4b065e39b45b91e/t/568de2f4e0327c7b8a288d06/14521377/TankardPaluck+2016.pdf. Доступ 19 апреля 2020 г.

  • Tasaduzzaman S (2015) Поставщик государственных услуг, Департамент охраны окружающей среды. В: Гунаван А. (ред.) В SFD Promotion Initaitives, Кхулна, Бангладеш, Заключительный отчет 2015. Опубликовано Eawag / Sandec, Швейцария.

  • Тейлор С.Е. (1975) Об установлении отношения к себе на основании поведения: некоторые ограничивающие условия. J Pers Soc Psychol 31: 126–131

    ADS Статья Google Scholar

  • Thye YP, Templeton MR, Ali M (2011) Критический обзор технологий опорожнения выгребных ям в развивающихся странах.Environ Sci Technol 41: 1793–1819

    Статья Google Scholar

  • Том Дж., Барнетт Т., Лью В., Селмантс Дж. (1987) «Подсказка потребителю: роль основных подсказок в восприятии потребителя». J Consum Mark 4 (2): 23–27. https://doi.org/10.1108/eb008193

    Статья Google Scholar

  • Tongco DC (2007) Целенаправленная выборка как инструмент отбора информаторов. Ethnobot Res Appl 5: 147–158. http://journals.sfu.ca/era/index.php/era/article/viewFile/126/111. По состоянию на 22 апреля 2020 г.

  • Тьяги А.Дж. (2017) Положение работников санитарии в Свачх-Бхарате. Журнал Техелка. http://www.tehelka.com/2017/10/predicament-of-sanitation-workers-in-swachh-bharat/. По состоянию на 10 апреля 2018 г.

  • USAID (Агентство США по международному развитию) (2010 г.) Экспресс-оценка управления канализационными стоками в Азии. USAID, Вашингтон, округ Колумбия

    Google Scholar

  • Валлахер Р.Р. (1993) Психологическая калибровка: создание рабочих отношений между разумом и действием.В: Wegner DM, Pennebaker JW (ред.) Справочник по ментальному контролю. Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ, стр. 443–472

    Google Scholar

  • Ван Влит Б.Дж.М., Спаргарен Г., Остервеер П. (2011) Санитария под угрозой: вклад социальных наук. Водная политика 13: 797–809

    Статья Google Scholar

  • Йи Н. , Бейленсон Дж. Н. (2009) Разница между бытием и видением: относительный вклад самовосприятия и прайминга в поведенческие изменения через цифровое саморепрезентацию.Медиа Психол 12 (2): 195–209. https://doi.org/10.1080/15213260

    9943

    Статья Google Scholar

  • Влаев И., Кинг Д., Дарзи А., Долан П., (2019) Изменение поведения в отношении здоровья с помощью финансовых стимулов: обзор поведенческой экономики. BMC Public Health 19: 1059 https://doi.org/10.1186/s12889-019-7407-8. https://bmcpublichealth.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s12889-019-7407-8. По состоянию на 30 апреля 2020 г.

  • ВОЗ и ЮНИСЕФ (2017) Прогресс в области питьевой воды, санитарии и гигиены: обновление и базовые показатели ЦУР.Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) и Детский фонд Организации Объединенных Наций (ЮНИСЕФ), Женева, http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/launch-version-report-jmp-water-sanitation-hygiene. pdf? ua = 1. По состоянию на 5 октября 2017 г.

  • Wicker AW (1969) Отношения против действий: взаимосвязь вербальных и явных поведенческих реакций на объекты отношения. J Soc, выпуск 25 (4 февраля): 41–78

    Статья Google Scholar

  • Авторы Википедии (2020) Хулна.В Википедии, Свободной энциклопедии. Получено 08:43, 12 мая 2020 г., с https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Khulna&oldid=3580. По состоянию на 12 мая 2020 г.

  • Wood S, Foster J, Kols A (2012) Понимание того, почему женщины применяют и поддерживают домашнюю очистку воды: выводы из программы дородовой помощи Малави. Soc Sci Med 75 (4): 634–642

    PubMed Статья Google Scholar

  • Инь Р.К. (2003) Пример исследования: дизайн и методы, 5-е изд.Sage Publications, Thousand Oaks

    Google Scholar

  • Выводы из литературы с использованием мета-анализа

    Поскольку исследования, проведенные разными учеными, показывают, что нынешний статус уличных детей в высшей степени информативен, это побуждает нас систематически анализировать существующую литературу с помощью мета-анализа. В этой статье 31 исследование было рассмотрено с применением заранее определенного набора критериев включения и исключения в рамках метаанализа.Эти исследования были собраны в основном на трех континентах (Африка, Азия и Латинская Америка), которые часто наблюдаются как диверсифицированные в экономическом, политическом, социальном и экологическом плане. Эмпирические данные, основанные на данных, полученных в результате рассмотренных исследований, дают целостную картину преобладания беспризорных детей мужского пола среди общей выборки, составляющей 68014 уличных детей. Подневная работа считается наиболее распространенным неформальным занятием для уличных детей. Эмпирические данные показывают, что большинство уличных жителей были отнесены к категории детей, работающих на улице в Африке, в то время как в Азии значительная часть из них была брошена из дома.Интересно, что это предполагает, что дети, выходящие на улицу, могут быть вызваны такими факторами давления, как принуждение со стороны семьи, отсутствие доступа к образованию и существование неприятной жизни в Африке, в то время как в Азии дети были вынуждены семьей просить милостыню и действовать как поденщик и уличный торговец, чтобы обеспечить средства к существованию своим брошенным семьям. Статистические данные, основанные на отношении шансов, свидетельствуют об отсутствии связи между местоположением исследуемого региона и характеристиками уличных детей. Результаты дисперсионного анализа показали, что на континенте существуют значительные различия по всем четырем переменным (условия жизни, образование, пол и стратегии обеспечения средств к существованию).Фактически, ежедневный труд был наиболее приемлемым средством заработка, за ним следуют уличные торговцы и другие. Нынешнее состояние беспризорных детей требует социального вмешательства для решения нынешних проблем уличных жителей путем обеспечения им устойчивых вариантов получения средств к существованию.

    1. Введение

    Огромные проблемы, с которыми столкнулись беспризорные дети в последние несколько лет, были изложены разными учеными в разное время и на разные темы философии [1, 2].Проблемы широко разбросаны (психологическое, физическое и сексуальное насилие), но в течение нескольких лет они не входили в программу общества [3]. Они исключены из экономических, социальных и политических процессов. Однако лишь несколько учреждений участвуют в оказании помощи им в поддержании средств к существованию. Это может привести будущее подающих надежду детей, а также подрастающее поколение к неконтролируемым вредным привычкам, которые влияют на политические (мир), социальные (нормы, культура) и экономику (на ВВП, ВНП) условия этих стран.

    Несмотря на то, что проблема беспризорных детей понимается как городское явление, факторы, усугубляющие эту проблему, в основном берут начало в сельской местности. Миграция из сельских районов в города в городские города по всему миру (краткий обзор миграции детей был задокументирован в отчете, подготовленном Уайтхедом и Хашимом [4]) не зависит от одного фактора, а вызвана сочетанием нескольких факторов. взаимосвязанные факторы выталкивания и притяжения [5, 6]. Обычно это связано с ухудшением условий жизни в сельской местности.Большинство этих детей вынуждены работать или жить на улице, чтобы обеспечить себя и свои семьи. Для многих из них представление о том, что более крупные города предлагают большие экономические возможности, делает улицу более привлекательной по сравнению с бедной сельской экономикой [7]. Однако жизнь ожидания в городе часто бывает сложной. У них часто нет образования и базовых навыков, необходимых для борьбы с факторами риска и преодоления невзгод. В этом контексте ожидается, что социальное вмешательство со стороны правительства или неправительственных организаций решит проблему возможностей получения средств к существованию для беспризорных детей.

    Хорошо известно, что НПО во всех сферах мира стремятся предоставить разумное решение экономических, социальных и экологических проблем общества и, таким образом, пытаются восполнить пробел, который не может быть восполнен местным правительством или государством. . Возвращаясь к историческому значению НПО, Эпштейн [8] обнаружил, что истоки НПО лежат в северной и южной частях США. Северные НПО были созданы после окончания Первой мировой войны, а в начале Второй мировой войны они распространили свою деятельность по всему миру.де Бенитес [9] проиллюстрировал роль Комитета НПО при ЮНИСЕФ (комитет включает всемирную сеть из 125 международных НПО, работающих от имени детей в более чем 110 странах мира) в удовлетворении основных потребностей беспризорных детей во всем мире. При оценке «широкой инициативы», реализованной ЮНИСЕФ для обездоленных детей, было обнаружено, что эта программа поощряет детей к получению начального школьного образования, поддерживает физическое и психологическое развитие детей, защищает от эндемических и хронических заболеваний и, в первую очередь, служит детям. чтобы оказать положительное влияние на их жизнь.Помимо этих международных организаций, в интересах беспризорных детей в разных странах мира работают и другие местные организации [3, 10]. Группа социального вмешательства в Мексике, EDNICA, работает не только для удовлетворения основных потребностей, но и для предоставления различных видов обучения и экономической поддержки уличным детям [10]. В рамках аналогичного мероприятия в Эфиопии НПО в сотрудничестве с Бюро по труду и социальным вопросам занимаются социально-экономическими проблемами беспризорных детей в городе Хавасса в Эфиопии [3].Несмотря на то, что эмпирические результаты предполагали, что большинство детей были исключены из компетенции НПО, работающих в этом районе, ожидалось, что эти организации могут способствовать благополучию детей из неблагополучных семей путем планирования, финансирования, управления и предоставления консультаций и консультационных услуг. Большинство этих программ были разработаны на основе принципа «лечебного подхода» в краткосрочной перспективе и, таким образом, игнорировали «превентивный подход», основанный на долгосрочном решении. На этом фоне в данной статье используется метаанализ для изучения вариантов средств к существованию, доступных для беспризорных детей, и роли социального вмешательства в защите их возможностей получения средств к существованию в разных странах мира.

    2. Концептуальные основы

    В двадцать первом веке хорошо известно, что беспризорные дети во всем мире сталкиваются с множеством физических и психических проблем. В этом контексте желательно разработать соответствующую дорожную карту для решения таких проблем. Концептуальная основа предназначена для выявления причин проблем беспризорных детей и роли вмешательства социальных предприятий в преодолении таких проблем (Рисунок 1).


    В существующей литературе было выявлено несколько причин, по которым дети становятся беспризорными, такие как взаимодействие факторов давления и притяжения (экологические, социальные и медицинские факторы) и отсутствие доступа к образованию [3, 24, 34] .Ожидается, что социальные меры будут способствовать благополучию детей за счет профессиональных навыков, связи услуг с местными ресурсами, деятельности, приносящей доход, и участия. В отличие от предыдущей модели охвата, эта альтернативная модель социального вмешательства имеет определенные далеко идущие последствия, а именно социально-экономические (повышение занятости, доходов, сбережений, профессиональных навыков, использование услуг, жилищная стабильность, а также социальные и трудовые сети), а также физическое или психическое здоровье. связанные результаты (повышение самооценки, мотивации и качества жизни и снижение рискованного поведения) [46].

    3. Материалы и методы
    3.1. Сбор данных

    В этой статье была предпринята систематическая попытка обзора существующей эмпирической литературы из стран Африки, Азии и Латинской Америки через призму метаанализа. Поиск производился следующим образом. В период с сентября 2015 г. по декабрь 2015 г. был произведен поиск опубликованных научных документов на английском языке в Академии Google и архиве (например, JSTOR). «бездомные дети»; «Дети, брошенные на улице»; и «социальное вмешательство».

    В процессе выполнения метаанализа, как показано на Рисунке 2, исследование собрало в общей сложности 158 документов о беспризорных детях. Включение и исключение исследований проводились на основании некоторых заранее определенных критериев в исследованиях: (i) возраст детей до 24 лет; (ii) соответствующее представление размера выборки, которая предоставляет информацию о гендерном составе, образовании, источниках средств к существованию, типе проживания на улице и среднем возрасте; (iii) исследования, написанные и опубликованные на английском языке; (iv) исследование, предоставляющее доступные данные; и (v) исследование, использующее количественный или смешанный метод исследования.


    Затем из 158 собранных документов на первом этапе было исключено 19 исследований из-за избыточности, 42 статьи только из-за качественного характера и 10 статей из-за того, что они были написаны на региональных языках. В итоге было просмотрено 87 статей. Но все же была неопределенность в определении возраста уличных детей в 22 исследованиях, и в итоге было выявлено 65 потенциальных статей. Путем применения другого критерия исключения 34 исследования были исключены: 9 исследований были исключены из-за недостаточной точности данных, а 25 из них не имели требуемых переменных.Наконец, 31 исследование было рассмотрено для нашего исследования по этому метаанализу. Данные, собранные из 31 статьи, были написаны в контексте трех разных континентов (Азии, Африки и Латинской Америки) мира. Среди 31 статьи большинство из 18 исследований посвящено изучению положения беспризорных детей и их проблем с обеспечением средств к существованию в контексте восточной, южной и западной частей Африки; 10 исследований проводились в контексте южной части Азии; 3 исследования были из южной части Америки.

    В избранном списке из 31 статьи три статьи были посвящены роли социального вмешательства в решении проблем беспризорных детей. Чтобы дать содержательный анализ социального вмешательства, мы собрали восемь новых исследований, которые основаны исключительно на социальном вмешательстве. Таким образом, у нас есть одиннадцать исследований, посвященных изучению роли социального вмешательства в решении проблем беспризорных детей.

    3.2. Анализ данных

    Исторически метаанализ был известен и применялся в исследованиях здоровья.Но в настоящее время он известен во многих областях социальных наук, таких как экономика и бизнес. В этой статье мы использовали метаанализ, который рассматривается как применение набора статистических инструментов и процесса, используемого для объединения результатов различных исследований [47, 48]. Следующие статистические инструменты были использованы для изучения различий в характерных особенностях уличных детей между странами.

    График отношения шансов и воронки . В процессе систематического обзора с использованием метаанализа мы часто знакомы с отношением шансов (OR) и его схематическим представлением, графиком воронки, для измерения связи между двумя номинальными переменными.В нашем исследовании мы определили отношение шансов следующим образом: отношение шансов = шансы характеристик уличных детей для группы I (скажем, Африки) / шансы характеристик уличных детей для группы II (скажем, остального мира).

    Доверительный интервал отношения шансов был рассчитан с использованием той же процедуры, что и доверительный интервал для среднего значения совокупности или доли совокупности, то есть точечной оценки (ln (OR) в исходной шкале) ± предел ошибок , где предел погрешности = критическое значение статистики (стандартное нормальное распределение при 95% доверительном интервале, т.е., 1.96) Стандартная ошибка.

    Чтобы вычислить ln (OR), мы преобразовали значение ln (OR), измеренное в натуральном логарифмическом масштабе, в исходный масштаб с помощью экспоненциальной функции. Если 95% доверительный интервал для OR не содержит 1,0, то можно сделать вывод, что существует статистически значимая связь между характеристиками уличных детей и местоположением исследуемой территории (т.е.континент).

    Воронкообразный график построен для проверки наличия систематической ошибки публикации с учетом доверительного интервала отношения шансов.Обычно он представляет собой доверительный интервал отношения шансов на горизонтальной оси и переменную категории, выбранную из обзорных исследований, на вертикальной оси.

    Анализ вариаций (ANOVA). ANOVA — один из таких статистических инструментов, используемый для разделения общей вариации, присутствующей в выборочных данных (собранных из различных исследований на трех континентах), на ряд компонентов, связанных с характером классификации данных. Для простоты мы разделили выборочные данные из различных исследований на две широкие категории: исследования, относящиеся к Африке, и исследования, относящиеся к остальному миру.Фактически, данные, полученные в результате серии независимых исследований, делятся на непересекающиеся группы (здесь две группы: Африка и остальной мир, т. Е.) На основе предварительно определенных независимых исследований в Африке и остальном мире. Количество оценок характеристик беспризорных детей в группах обозначено, где. Оценка, рассчитанная по каждому исследованию, обозначена с дисперсией. Оценка среднего группового эффекта для th группы () может быть записана как где вес является обратной величиной дисперсии; то есть

    В большинстве базовых исследований дисперсия не сообщается.В качестве альтернативы, мы начали наш анализ, придавая всем рассматриваемым исследованиям одинаковый вес. Затем в документе были присвоены веса исследованиям. В этом анализе мы удобно заменили неизвестную дисперсию расчетной дисперсией, которая является функцией размера выборки в рамках исследования и оценки размера эффекта. Однако мы провели анализ, рассматривая как равные, так и неравные дисперсии.

    Общее среднее значение равно

    . Чтобы проверить отсутствие вариации оценок населения по характеристикам уличных детей в группах исследований на континенте, мы использовали статистику теста.Рассчитанное значение статистики теста в группе равно

    . При нулевой гипотезе об отсутствии вариации оценок совокупности тест следует распределению с () степенями свободы.

    Аналогичным образом мы провели тест на различия между группами, то есть на различия в характеристиках уличных детей на разных континентах. Статистика теста представлена ​​как

    При нулевой гипотезе статистика теста следует распределению с () степенями свободы.

    Наконец, общая вариация может быть вычислена как

    4. Результаты и обсуждение
    4.1. Демографические характеристики

    В целом наша окончательная выборка из 31 исследования выявила наличие 68014 беспризорных детей на трех разных континентах. В таблице 1 кратко представлен демографический профиль беспризорных детей. Видно, что 71,84% (48863) из них составляли мальчики, а остальные 28,16% (19151) — девочки в составе уличных жителей.В этом составе наблюдался меньший процент молодых женщин. Это может быть отражением предвзятого отношения к скрытому характеру активности уличных девочек для поддержания средств к существованию на улице [3].

    Мальчик % Девушка (%) — — Accra Кения Кения (Кит. (121031) (12,6567) ) Индия (Мумбаи) ,00

    SN Первый автор (справочный номер) Год Страна Образец Пол Средний возраст Неграмотные (%) Грамотные (%) Нет ответа (%)

    1 Sorsa [11] 2002 w Эфиопия 479 435 (90.81) 44 (9,19) 13 118 (24,63) 361 (75,37) 0
    2 ЮНИСЕФ [12] 2000 Эфиопия) 910 (Аддис 153 (63,75) 87 (36,25) 11 13 (5,42) 227 (94,58) 0
    2000 Эфиопия (Бахир Дар) 41067 4 ) 120 (27,27) 14 88 (20.00) 352 (80,00) 0
    2000 Эфиопия (Десси) 339 224 (66,08) 115 (33,92) 14 14 2310 (6 93,22) 0
    2000 Эфиопия (Комбольча) 312 227 (72,76) 85 (27,24) 14 49 (15,71) 01072 0
    3 Mulugeta [13] 2005 Эфиопия (Аддис-Абеба) 191 146 (76.44) 45 (23,56) 11 11 (5,76) 180 (94,24) 0
    4 Хабтаму [14] 2013 2 Эфиопия 42 (Эфиопия) 314 (74,41) 108 (25,59) 15 39 (9,24) 383 (90,76) 0
    5 Кебеде [3] w 170 139 (81.76) 31 (18,24) 13
    6 Икечебелу, [15] 2008 Нигерия 186 186 186 186 14 24 (12,90) 162 (87,10) 0
    7 Owoaje [16] 2009 Нигерия 360 910 (58,37) 14 14 (3.89) 346 (96,11) 0
    8 Экпикен-Эканем [17] 2014 Нигерия 3036 2916 (96,05)
    9 Балет [18] 2010 Мадагаскар 100 57 (57,00) 43 (43,00) 8,5
    10 Анарфи [19] 1997 Гана (Аккра) 1147 688 (59.98) 459 (40,02) 16 427 (37,23) 720 (62,77) 0
    11 Asante [20] 2014 122 (53,74) 105 (46,26) 14 69 (30,40) 157 (69,16) 0
    12 WERK [21] 2002 9981 7476 (74,90) 2505 (25.10) 12,5 4566 (45,75) 3061 (30,67) 2354 (23,58)
    13 Оума [22] 2004 281072 2270 (44,06) 14 418 (8,11) 3757 (72,92) 977 (18,96)
    14 Омонди [23] 2015 74 (74,75) 25 (25.25) 13,5 4 (4,04) 95 (95,96) 0
    15 Кипегон [24] 2015 Кения (Элдорет) 17 (22,67) 13
    16 Snell [25] 2003 Южная Африка 30 0 3 (10.00) 27 (90,00) 0
    17 Каммингс [26] 2006 Сьерра-Леоне 166 71 (42,77) 95 (5710,2310) 910,57 (78,31) 36 (21,69) 0
    18 Аль-Дьен [27] 2009 Египет 2603 2053 (78,87) 550 — 910,13 0 2603 (100.00) 0
    Промежуточный итог (Африка) 25755 18565 (72,08) 7190 (27,92) 13,15 5996 (23,28)
    19 Гайдхан [28] 2008 Индия (Мумбаи) 163 163 (100,00) 0 16,5 Бал [29] 2010 Индия (Калькутта) 554 362 (65.34) 192 (34,66) 13 258 (46,57) 296 (53,43) 0
    21 Гупта [30] 2012 Индия (Сангам) 84 (84,00) 16 (16,00) 10 85 (85,00) 15 (15,00) 0
    22 Мукерджи [31] ) Индия (Колата) 2014 600 392 (65.33) 208 (34,67) 9 170 (28,33) 430 (71,67) 0
    23 TISS [32] 2015 25960 (70,05) 11099 (29,95) 9 8940 (24,12) 19871 (53,62) 8248 (22,26)
    24 910 Тхане ) 121 80 (66.12) 41 (33,88) 11 42 (34,71) 79 (65,29) 0
    25 Ахмед [34] 2003 1067 Бангладеш 97,51) 64 (2,49) 13 1562 (60,71) 1011 (39,29) 0
    26 Ислам [35] 2013 100 100 910 50.00) 50 (50.00) 13 34 (34,00) 41 (41,00) 25 (25,00)
    27 Vedadi [36] 2013 Пакистан 250 115 135 (54,00) 9 33 (13,20) 217 (86,80) 0
    28 Бейкер [37] 1997 Непал 10 130 0 13
    Промежуточный итог (Азия) 41650 29845 (71.66) 11805 (28,34) 11,65 11124 (26,71) 21960 (52,73) 8273 (19,86)
    29 Campos [381067] 910 291 (76,78) 88 (23,22) 13,5
    30 Рафаэлли [39] 2005 Бразилия 34 (49.28) 14,5 28 (40,58) 41 (59,42) 0
    31 де Карвалью [40] 2006 Бразилия 161 127 (21,12) 14 53 (32,92) 81 (50,31) 27 (16,77)
    Промежуточный итог (Латинская Америка) 609 453 (74,38) 1561072 453 (74,38) 14 81 (13.30) 122 (20,03) 27 (4,43)
    Всего (все континенты) 68014 48863 (71,84) 19151 (28,16) 12,9 35128 (51,65) 11631 (17,10)

    Что касается уровня образования детей, то никаких различий между континентами (особенно в Африке и Азии) не отмечено. Причина высокого уровня плохого образования уличных детей заключалась в том, что они часто привыкали к уличной жизни в ранние годы жизни [35].В Африке из 25755 детей в исследованной выборке 23,28 процента были неграмотными, а остальные 50,65 процента были грамотными. И мы наблюдали 27,37-процентный разрыв в уровне грамотности уличных жителей в Африке. Аналогичный разрыв в грамотности (26.02) был выявлен в Азии. Но исследования, проведенные в Латинской Америке, показали самый низкий разрыв в уровне грамотности (6,73). Этот разрыв в уровне грамотности, особенно в Латинской Америке, требует социального вмешательства для повышения образовательного статуса беспризорных детей; в противном случае проблема неграмотности может резко обостриться в будущем.

    4.2. Классификация уличных детей и условий жизни

    Согласно классификации ЮНИСЕФ, беспризорных детей можно разделить на детей, работающих на улице (на улице), детей, живущих на улице (на улице), и детей из беспризорных семей (брошенные) [ 49]. Соответственно данные, собранные из проанализированной литературы, как показано в Таблице 2, показали, что из 25755 беспризорных детей в Африке 37,55% из них работают днем ​​на улице и возвращаются домой вечером; 11.10% постоянно жили на улице. Количество брошенных детей было крайне низким. Среди детей, живущих на улице, 38,15% живут с семьей, а 11,96% — одни или с друзьями.

    улица 39103 3910 Эфиопия 6510.00) 67 67 Южная Африка 30 22.29) 54,67) (810.02) (810,02) 67 0 27 (22,31) 0 9107 (22.90) 2005

    SN Первый автор (справочный номер) Год Страна Образец Категория детей % Условия проживания 73
    Живут на улице (%) Брошенные (%) Другие (%) С семьей (%) Один / друзья (%)

    1 Sorsa 11] 2002 Эфиопия (Хвасса) 479 201 (41.96) 278 (58,04) 0 0 201 (41,96) 278 (58,04)
    2 ЮНИСЕФ [12] 2000 240 Эфиопия (Аддис) 66 (27,50) 174 (72,50) 0 0 66 (27,50) 174 (72,50)
    2000 Эфиопия (Бахир Дар) 440 ) 216 (49,09) 0 0 224 (50.91) 216 (49,09)
    2000 Эфиопия (Десси) 339 134 (39,53) 197 (58,11) 0 8 (2,36 134) 197 (58,11)
    2000 Эфиопия (Комбольча) 312 191 (61,22) 121 (38,78) 0 0 191,7
    3 Mulugeta [13] 2005 Эфиопия (Аддис-Абеба) 191 72 41067 14] 2013 Эфиопия (Аддис-Абеба) 422 113 (26.78) 309 (73,22) 0 0 43 (10,19) 379 (89,81)
    5 Кебеде [3] 2015 Эфиопия
    6 Икечебелу, [15] 2008 Нигерия — 186 — 186
    7 Owoaje [16] 2009 Нигерия 360 126 (35,00)
    8 Экпикен-Эканем [17] 2014 Нигерия 3036 72
    9 Балет [18] 2010 Мадагаскар 100 95 (95,00) 5 (5,00) 0 0 95 (95,00) 72 51067 5
    10 Анарфи [19] 1997 Гана (Аккра) 1147 ] 2014 Гана (Аккра) 227
    12 WERK [21] 9981 8499 (85.15) 1482 (14,85) 0 0 8499 (85,15) 1482 (14,85)
    13 Оума [22] 2004
    14 Омонди [23] 2015 Кения (Китале) 99 72
    15 Кипьегон [24] 2015 Кения (Элдорет) 75 35 (46.67) 39 (52,00) 1 (1,33) 0 27 (36,00%) 48 (64,00)
    16 Snell [25] 2003
    17 Каммингс [26] 2006 Сьерра-Леоне 2 (1.20) 0 112 (67,47) 54 (32,53)
    18 Аль-Дьен [27] 2009 Египет 2603
    Промежуточный итог (Африка) 25755 9670 (37,55) 2858 (11,10) 3 (0,01) 8 (0,03) 98 (0,03) 3080 (11,96)
    19 Гайдхан [28] 2008 Индия (Мумбаи) 163 83 (50.92) 80 (49,08) 0 0 83 (50,92) 80 (49,08)
    20 Бал [29] 2010 Индия (Калькутта) 83 (14,98) 0 471 (85,02) 0
    21 Гупта [30] 2012 Индия ( 100) (74,00) 26 (26,00) 0 0 74 (74.00) 26 (26,00)
    22 Мукерджи [31] 2014 Индия (Калькутта) 600 0 0 600 (100,00) 272 (45,33)
    23 TISS [32] 2015 Индия (Мумбаи) 37059 9056 (24.09.44) 2 2 910 (2,46) 9056 (24.44) 27093 (73,11)
    24 Чанд [33] Индия (Тан) 121 27 (22,31) 94 (77,69) 94 (77,69)
    25 Ахмед [34] 2003 Бангладеш 2573 149 (5,79) 2424 (94,211067) 2573 (100.00)
    26 Ислам [35] 2013 Бангладеш 100 43 (43.00) 57 (57.00) 0 0 1072 (4310.00) 57,00)
    27 Ведади [36] 2013 Пакистан 250 21 (8,40) 229 (91,60) 0 0 72 28 Бейкер [37] 1997 Непал 130
    72
    72 5883 (14,12) 25191 (60,48) 910 (2,18) 9611 (23,08) 30195 (72,50)
    29 Campos [38] 72 1994 379 157 (41,42) 152 (40,11) 0 70 (18,47) 157 (41,42) 222 (58,58)
    30 Бразилия 69
    31 де Карвалью [40] 2006 10 Бразилия —
    Промежуточный итог (Латинская Америка)
    609 157 (25.78) 152 (24,96) 0 70 (11,49) 157 (25,78) 222 (36,45)
    Всего (все континенты) 68014 1 68014 8893 (13,08) 25194 (37,04) 988 (1,45) 10210 (15,01) 6404 (9,42)

    Большинство выбранных исследований в Азии показали, что десять 60 процентов беспризорных детей (из 41650 беспризорных детей) жили на улице со своей семьей.В отличие от других континентов, азиатские исследования показали, что родители с низким экономическим статусом мигрировали на улицы города вместе со своими детьми [1, 32] и, таким образом, столкнулись с рядом проблем на улице из-за небезопасной среды, в которой они живут [36, 50]. Из-за недостаточного количества исследований в Латинской Америке нельзя сделать какие-либо систематические выводы. Однако не существует значительных различий в процентной доле детей, работающих на улице, по сравнению с живущими на улице.

    Сравнение характера беспризорных детей на трех континентах показало, что в Африке большинство уличных жителей были отнесены к категории живущих на улице из-за наличия таких факторов, как мотивация членов семьи, неблагоприятная образовательная среда и отсутствие основных потребностей. , в то время как в Азии детей заставляли попрошайничать и действовать в качестве поденщиков и уличных торговцев, чтобы обеспечить средства к существованию своим брошенным семьям.Таким образом, на обоих континентах дети часто приносили жертвы, чтобы обезопасить жизнь своих скрытых родителей, живущих в их доме в Африке, и незаметных родителей, живущих на улице в Азии.

    4.3. Средства к существованию уличных детей

    Для изучения разнообразия вариантов получения средств к существованию, которыми пользуются беспризорные дети, в существующей литературе была представлена ​​информация о трех широких категориях неформальной деятельности: уличный попрошайка, уличный поденщик и уличный торговец. При таком подходе, несмотря на то, что мы рассмотрели 31 исследование на трех континентах, по 15 исследованиям не было обнаружено никакой информации о диверсификации источников средств к существованию.В частности, исследования в Африке и Латинской Америке не содержали количественной информации о средствах к существованию. Как указано в Таблице 3, из общего размера выборки уличных детей в африканских странах лишь немногие из них обеспечивали себя и свои семьи попрошайничеством (1,06%) и уличной торговлей (4,13%), а остальные 7,68% занимались повседневным трудом. В Латинской Америке только 69 респондентов из 609 беспризорных детей сообщили о своих альтернативных средствах к существованию. Учитывая общий размер выборки уличных детей, оказалось, что 0.66% из них занимались попрошайничеством, 2,13% выполняли повседневный труд, а 8,54% выполняли различные другие обязанности.

    Попрошайничество (%) 910 67 Эфиопия 91 067 Кипьегон [24] Индия (Колката) (3.79) (9.33) 16 Азия 3406 (8.18) де Карвалью [40] (30.69)

    Номер исследования Первый автор (ссылочный номер) Год Страна Образец Средства к существованию
    Уличный продавец (%) Прочие (%)

    1 Сорса [11] 2002 Эфиопия (Хвасса) 471067 — 479 —
    2 ЮНИСЕФ [12] 2000 Эфиопия (Аддис-Абеба) 240 0 140 (58.33) 69 (28,75) 4 (1,67)
    2000 Эфиопия (Бахир Дар) 440 0 207 (47,05) 199 (45,23)
    2000 Эфиопия (Десси) 339 32 (9,44) 203 (59,88) 104 (30,68) 0
    0 155 (49.68) 91 (29,17) 66 (21,15)
    3 Мулугета [13] 2005 Эфиопия (Аддис-Абеба) 191 0 (36,13) 29 (15,18)
    4 Хабтаму [14] 2013 Эфиопия (Аддис-Абеба) 422 0 336 (7 910) 910 37 (8,77)
    5 Кебеде [3] 2015 Эфиопия (Хвасса) 170 65 (38.24) 92 (54,12) 13 (7,65) 0
    6 Икечебелу, [15] 2008 Нигерия 186 72
    7 Owoaje [16] 2009 Нигерия 360
    8 Ekken Нигерия 3036
    9 Балет [18] 2010 Мадагаскар 100 100 (100.00) 0 0 0
    10 Анарфи [19] 1997 Гана (Аккра) 1147 8 (0,70) 418 36,18) 6 (0,52)
    11 Асанте [20] 2014 Гана (Аккра) 227 72 — WERK [21] 2002 Кения (Найроби) 9981
    13 Ouma [22] 72
    14 Omondi [23] 2015 Кения (Китале) 99 2015 Кения (Элдорет) 75
    16 Снелл [25] 2003 Южная Африка
    17 Каммингс [26] 2006 Сьерра-Леоне 166 69 (41.57) 31 (18,67) 55 (33,13) 11 (6,63)
    18 Аль-Дьен [27] 2009 Египет 2603
    Промежуточный итог (Африка) 25755 274 (1,06) 1977 (7,68) 1064 (4,13) 187 (0,78)
    1 1 2008 Индия (Мумбаи) 163
    20 Бал [29] 5510 172 (31,05) 0 361 (65,16)
    21 Гупта [30] 2012 Индия (Сангам Вихар) 100 100 910 (64,00) 27 (27,00) 0
    22 Мукерджи [31] 2014 Индия (Калькутта) 600 118 (19,67) 0
    23 TISS [32] 2015 Индия (Мумбаи) 37059 2934 (7.92) 10117 (27,30) 4263 (11,50) 19745 (53,28)
    24 Chande [33] Индия (Thane) 121 72 — —
    25 Ахмед [34] 2003 Бангладеш 2573 274 (10,65) 1612 (62,65) 195 (7,51067)
    26 Ислам [35] 2013 Бангладеш 100 0 27 (27.00) 48 (48,00) 25 (25,00)
    27 Ведади [36] 2013 Пакистан 250 26 (10,40) 207 (82,1067) 6.80) 0
    28 Бейкер [37] 1997 Непал 130
    12570 (30,18) 4606 (11,06) 20637 (49,55)
    29 Кампос [38] 1994 Бразилия 379 72
    30 Рафаэлли [39] 2005 Бразилия 69 4 (5,80) 13 (18,84) 0 52 (3 2006 Бразилия 161
    Промежуточный итог (Латинская Америка) 609 4 (0.66) 13 (2,13) ​​ 0 52 (8,54)
    Всего (все континенты) 68014 3684 (5,42) 14560 (21,41) 56706 56706

    Интересно, что 99% респондентов в Азии, участвовавших в 10 различных исследованиях, сообщили о различных вариантах средств к существованию; Попрошайничеством занимались 8,18% уличных детей, 30.18% выполняли повседневную работу, 11,06% из них занимались уличной торговлей, а большинство 49,55% занимались другими видами деятельности. В частности, большинство уличных детей, работающих на подневольной работе, выполняли тяжелые работы на промышленных предприятиях. Они были вынуждены работать поденщиками во вредных производственных условиях. Исследование, проведенное в Калькутте, показало, что почти 38% из 468 уличных детей работают в качестве поденщиков в опасных условиях [31].

    4.4. Социальное вмешательство в отношении беспризорных детей

    Мы рассмотрели одиннадцать статей, чтобы определить роль социального вмешательства в решении проблем уличных детей.Среди отобранных статей были недавно включены восемь статей, посвященных исследованию роли социального вмешательства. Кроме того, мы приложили искренние усилия для поиска количества уличных детей, обслуживаемых этими организациями, на их соответствующих веб-сайтах. Однако из рассмотренных статей видно, что всего на этих трех континентах работали 18 НПО и одна ассоциация общественных работ (Таблица 4). В Африке, особенно в Эфиопии, существует ряд НПО, работающих с беспризорными детьми.Из них 12 НПО работали исключительно в Эфиопии. Согласно данным, полученным из четырех статей в Эфиопии, эти 12 НПО поддержали 359 960 детей. Было установлено, что местная неправительственная организация «Сирота и школа Абебека Гобена» в Эфиопии оказала помощь 2 50 832 беспризорным детям, предоставив им образование.

    6 .Все пациенты должны были быть пробандами с доступными данными WGS и иметь хотя бы один нормализованный термин для конкретного заболевания, соответствующий термину «кардиомиопатия». Лица с дополнительными синдромными терминами онтологии фенотипа человека (HPO) были исключены. Когорта включала 745 подтипов HCM, 355 DCM, 43 LVNC и 119 подтипов AVC; 22% были моложе 21 года на момент постановки диагноза; 62% были мужчинами, 82% имели европейское происхождение. Где возможно, короткие вызовы вариантов (SNV и инделки) получали после выравнивания с эталонным геномом hg38, в противном случае использовали вызовы вариантов GRCh47.Варианты были отфильтрованы так, чтобы требовать флаг «PASS» и иметь минимальную общую глубину чтения (DP / DPI), равную 10. Вызовы вариантов hg38 и GRCh47 были преобразованы в hg19 с помощью Picard LiftoverVcf (http://broadinstitute.github.io/picard /). Анализ вариативной нагрузки в случаях из проекта «100000 геномов» был выполнен, как описано ранее, путем сравнения с контрольной когортой ICGC.

    Анализ обогащения пути

    Анализ обогащения пути был выполнен с использованием g: Profiler с параметрами по умолчанию (https: // biit.cs.ut.ee/gprofiler) 107 . Набор генов, кодирующих белок, был ранжирован согласно общему количеству патогенных SNV, инделей и CNV, наблюдаемых в нашей когорте. Набор регуляторных генов был ранжирован согласно общему количеству приоритетных регуляторных вариантов, наблюдаемых среди неуловимых генов. Скорректированные p-значения были рассчитаны с использованием поправки Бонферрони, и только пути с скорректированным p-значением <0,05 считались значимыми.

    Анализ подгрупп

    Для сравнения вариативной нагрузки в генах или путях кодирования CMP между подтипами CMP была построена серия таблиц сопряженности 2 × 2, в которых каждый подтип был протестирован против всех других для каждого гена или пути.Случай считался положительным, если он содержал хотя бы один патогенный вариант (SNV, indel и / или CNV), в противном случае он считался отрицательным. Точно так же в тестах на ассоциации с клиническим исходом использовались таблицы сопряженности 2 × 2, и случай считался положительным, если он имел хотя бы один интересующий вариант. Эквивалентно, тесты нагрузки для нескольких вариантов любого типа, помеченные как «положительные» случаи, как те, которые несут два или более любых вариантов для тестируемого гена или пути. P-значения были рассчитаны с использованием двустороннего точного критерия Фишера.Чтобы уменьшить смещение в расчетах OR и избежать «нулевых ячеек» в таблицах непредвиденных обстоятельств, к каждой наблюдаемой частоте было добавлено 0,5 (поправка Холдейна-Анскомба). Коэффициент ложного обнаружения (FDR) применялся после удаления тестов, в которых не наблюдались варианты ни в каких образцах для каждого набора тестов (генов или путей). Для выявления обогащения саркомерными / цитоскелетными генами среди всех приоритетных регуляторных вариантов был использован двусторонний биномиальный тест. Каждый вариант считался «успешным», если вариант был связан с саркомерным геном, и считался «неудачным», если вариант был связан с другой категорией генов.Априорная вероятность «успеха» была установлена ​​на уровне 8/133, т.е. равна доле саркомерных генов среди общего набора известных генов CMP. Все статистические анализы были выполнены с использованием статистического программного обеспечения R версии 3.5.1.

    Экспрессия гена и белка миокарда

    Миокард LV был получен от пациентов с CMP, которые согласились на создание биобанков из оставшейся ткани во время кардиохирургии или трансплантации сердца, и был немедленно заморожен в операционной и хранился в жидком азоте.

    Секвенирование РНК (RNAseq)

    Для измерения экспрессии гена миокарда RNAseq выполняли с использованием платформы Illumina HiSeq 2500 в TCAG в 35 образцах LV. Тотальную РНК выделяли из образцов миокарда ЛЖ с помощью набора RNeasy Mini (QIAGEN, Канада). Сгенерированные необработанные данные последовательности фильтровали в соответствии с процедурами, описанными ранее 108 . Отфильтрованные считывания последовательностей были сопоставлены с браузером генома человека UCSC hg19 с использованием Tophat v.2.0.11 и обработаны для извлечения необработанных счетчиков считываний для генов с использованием htseq-count v.0.6.1p2. Данные секвенирования были сопоставлены с человеческим транскриптомом с использованием сплайсированного выравнивателя HISAT2 109 , а уровень экспрессии гена был количественно оценен с использованием StringTie 110 . Чтения на килобазу транскриптов на миллион сгенерированных были нормализованы по размеру каждой библиотеки и нормализованы по длине транскриптов. Нормализованные данные RNAseq для генов, проанализированных в этом исследовании, доступны в Supplementary Table 10 . Анализ экспрессии был проведен для определения разницы в кратности экспрессии мРНК у пациента с положительным вариантом по сравнению со средними значениями в остальной когорте (т.е.е. пациенты без кандидата SNV или CNV на WGS) 111 .

    qRT-PCR

    Для дополнительного подтверждения разницы в уровне экспрессии мРНК гена, несущего вариант, по сравнению с последовательностями дикого типа, мы определили относительную экспрессию мРНК с помощью qRT-PCR 112 . Суммарную РНК экстрагировали из миокарда левого желудочка пациента с использованием РНК mirVana ™ PARIS ™ и набора для очистки нативного белка (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) в соответствии с протоколом производителя.Концентрацию и чистоту РНК оценивали с помощью Nanodrop 2000c (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA). РНК с соотношением A260 / 280 2,0 ± 0,05 дополнительно оценивали на ее целостность с использованием TapeStation 4200 (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США). Образцы РНК с числом целостности РНК выше 5 и соотношением рРНК 1,7-2,0 использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы SuperScript IV (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Специфические олигонуклеотидные праймеры для каждого варианта ( Дополнительная таблица 11, ) были сконструированы с помощью primer3-NCBI ( https: // www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ ) и синтезированы с помощью технологий Integrated DNA (Коралвилл, Айова, США). Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH, человек) использовалась в качестве гена домашнего хозяйства для нормализации. QRT-PCR выполняли в системе qPCR ViiA7 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) с использованием PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Общий объем реакции ПЦР составлял 10 мкл, а условия ПЦР состояли из стадии выдержки при 50 ° C в течение 2 минут, затем при 95 ° C в течение 2 минут с последующими 40 циклами по 15 секунд при 95 ° C и 15 секунд при 55 ° C. 60 ° C (зависит от температуры праймера) и 72 ° C в течение 1 мин.Относительное количественное определение мРНК было выполнено с использованием метода 2 -ΔΔ C t 113 . Экспрессия мРНК генов-мишеней в миокарде ЛЖ пациента, несущего этот вариант, сравнивалась с тканями дикого типа, полученными от других людей, включая образец аутопсии от человека без сердечного заболевания, а также пациентов с CMP, которые не имели какого-либо известного патогенного кодирования. или регуляторные варианты. Эксперименты проводились три независимых раза, и каждый эксперимент включал 3 технических повтора.Различия между пациентами с вариантом и пациентами без варианта анализировали с использованием непарного t-критерия Стьюдента и считали значимыми при p <0,05.

    Вестерн-блот

    Чтобы определить, связано ли изменение экспрессии мРНК с изменением экспрессии белка, проводили вестерн-блоттинг для оценки экспрессии белка миокарда 114,115 . Замороженные ткани гомогенизировали в жидком азоте и лизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) и коктейле ингибиторов протеаз (Sigma, St.Луис, Миссури, США). Образцы смешивали с загрузочным буфером, нагревали при 90 ° C в течение 5 минут, разделяли с помощью SDS-блоттинга 4-12% Bis-Tris plus (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. После блокирования мембраны 5% обезжиренным сухим молоком в фосфатном буферном солевом растворе (PBS; pH: 7,4) мембрану инкубировали либо с кроличьими моноклональными антителами FKTN (ab131280; abcam, Кембридж, Великобритания), либо с кроличьими поликлональными TGF. β 3 антитело (ab15537, abcam, Кембридж, Великобритания), кроличье PRKAG2 Поликлональное антитело (MBS

    Дата основания Сбор данных 910 Кения Кения (USK) Организация поддержки детей Алем 1067 67 Семейная организация с интегрированными услугами 9 5. Доверительный интервал отношения шансов: график-воронка

    В исследовании мы выбрали априорную классификацию уличных детей в существующей литературе, то есть исследования, относящиеся к Африке, и исследования, относящиеся к остальному миру. В зависимости от четырех индивидуальных характеристик уличных детей (а именно, условий жизни, уровня грамотности, гендерного состава и возможностей заработка) для Африки и остального мира были определены группа случаев и контрольная группа. Соответственно, мы рассчитали отношение шансов для группы случаев и контрольной группы и представили их в таблице 5.Например, дети, не живущие на улице, попали в категорию контрольной группы, а дети, живущие на улице, были включены в группу наблюдения. Эмпирические данные показывают, что отношение шансов условий жизни в Африке по сравнению с остальным миром составляет 1,75, что указывает на почти равные шансы условий жизни в Азии и остальном мире. Более того, наблюдается, что доверительный интервал (95%) отношения шансов действительно включает значение 1,0. На рисунке 3 показано схематическое представление доверительного интервала в виде воронкообразного графика.Таким образом, это говорит нам об отсутствии существенной связи между условиями жизни беспризорных детей и континентом, рассматриваемым в исследованиях. Другими словами, место проведения исследования не оказывает существенного влияния на жилищные условия детей улицы. Интересно, что два других критерия беспризорных детей (а именно, пол и грамотность) не связаны с местоположением изучаемой территории. Однако более высокое значение отношения шансов в категории условий получения средств к существованию (т. Е. 2,957) предполагает увеличение шансов условий для получения средств к существованию в Африке.Другими словами, вероятность ежедневного труда как основного источника средств к существованию в Африке оказывается выше по сравнению с остальным миром. Связь местоположения изучаемого региона и условий жизни беспризорных детей является статистически значимой.


    SN Первый автор (ссылочный номер) Год Страна Имя исполнителя Форма организации Улица
    С веб-сайта Обзор исследований

    1 Scanlon [41] 1993 Бразилия Центр защиты детей (CDM) 72 Сообщество 72 3000
    2 Скэнлон [42] 1998 Бразилия Национальное движение беспризорных детей НПО 1985 44 000 31067 M1067 2014 Индия Авас Йодзина 155
    4 О’Кейн [43] 2003 Индия Бабочки NGO 1989 54000 51067 ] 1997 Непал CWIN (Дети-работники в Непале) НПО 1987 130
    6 Оума [22] НПО 1973
    7 Аль-Дьен [27] 2009 Египет Общество деревни надежды НПО 9103
    8 Фариас [44] 2012 Эфиопия Сид Африка НПО 2008 600 91 072
    9 Кебеде [3] 2015 Эфиопия Центр заботы НПО 2005 170
    1067 Эфиопия 84
    11 Williamson [45] 2000 Эфиопия 72
    Эфиопия Сирота и школа Абебека Гобена НПО 1980 250,832
    Эфиопия Алем НПО1067 Комплексный проект реабилитации Годанау ct для беспризорных детей НПО 1995 1332
    Эфиопия Иерусалимская ассоциация детских домов НПО 1985 3,200 3,200 НПО 1995 843
    Эфиопия Ассоциация развития детей и женщин долины Рифит (RCWDA) НПО 1993 НПО 1995 2 891
    Помощь детям — Эфиопия НПО 86,400
    N в доверительном интервале в исходной шкале 2 67 Верхний предел 910 LN доверительной шкалы 0.043963 1 019341 Верхний предел L в доверительной шкале L исходной шкалы OR

    Условия жизни : Проживание на улице Да Нет
    Африка 2858 72 2858 35864
    ИЛИ 1.754379
    ln (OR) = точечная оценка 0,562115
    Var [ln (OR)] 0,000647
    SE 0,025432
    0,611961
    Нижний предел доверительного интервала в шкале LN -1,1988
    Верхний предел доверительного интервала в исходной шкале 1,844044
    Нижний предел доверительного интервала 0.301557

    Грамотный Да Нет
    Африка 16377 5996
    Остальное
    ln (OR) = Точечная оценка 0,007295
    Var [ln (OR)] 0,00035
    SE 0,018708
    Нижняя граница доверительного интервала в шкале LN −0,08582
    Верхняя граница доверительного интервала исходной шкалы 1.044944
    Нижняя граница доверительного интервала исходной шкалы 0,

    Пол Мальчик Девочка
    Африка 18565 7190
    ln (OR) = Точечная оценка 0,019157
    Var [ln (OR)] 0,00031
    SE 0,017594
    0,053641
    Нижний предел доверительного интервала в шкале LN −0,10483
    Верхний предел доверительного интервала в исходной шкале 1.055106
    Нижний предел доверительного интервала 0.

    Средства к существованию : ежедневная рабочая сила Да Нет
    Африка 1977 1525 72 2.1
    ln (OR) = Точечная оценка 1.084311
    Var [ln (OR)] 0.001276
    SE 0.035719
    Верхний предел доверительного интервала в шкале LN 1,15432
    Нижний предел доверительного интервала в шкале LN −2,26119
    Верхний предел доверительного интервала в исходной шкале 1085 3,171867
    Нижний предел доверительного интервала в исходной шкале 0,104226


    4.6. Различия в характеристиках уличных детей на разных континентах: ANOVA

    В исследовании предпринимается попытка изучить вариации внутри группы и между группами (Африка и остальной мир) в рамках ANOVA. На основе четырех критериев (условия жизни, образование, пол и стратегии жизнеобеспечения) уличных детей определяются различия внутри континента и между континентами. Межстрановые различия характеристик уличных детей на карте мира представлены на Рисунке 4.


    В рамках ANOVA сначала мы начали с присвоения равных весов всем исследованиям (таблица 6), а затем представили результаты с разными весами исследованиям, основанным на наблюдаемом стандартном отклонении (таблица 7). Соответственно, результаты показывают, что внутри континента существуют значительные различия по всем четырем критериям как в невзвешенном, так и в взвешенном анализе. Но нет значительной разницы между двумя группами (Африка и остальной мир), за исключением образования.Это указывает на то, что средний процент грамотных уличных детей в Африке выше по сравнению с остальным миром. Это возможно благодаря активному участию африканских НПО в кампании по распространению грамотности среди беспризорных детей. Другими словами, большинство из 79 процентов уличных детей, уличных детей и брошенных детей посещают свою программу обучения грамоте в Африке по сравнению с остальным миром (54 процента). В целом статистические данные, основанные на результатах систематизированного обзора, подтверждают вклад социальных мероприятий в образование уличных детей в Африке.Необходимо расширить охват деятельности по социальному вмешательству в обеспечении возможностей заработка для беспризорных детей на всех континентах мира.

    67 58 (15,51072) (15,51072)

    Критерии Группа Этикетка Размер группы Среднее значение Среднее t -тест Жизнь на улице 1 Африка 10 44.61 0,02 0,03 16547,28
    2 Остальное 10 44,37 (0,99) 1072 (0,99) 1072
    Грамотный 1 Африка 17 78,77 11878,70
    2 (0,01) (25,00) (15,51) (3,80)
    Девочки 1 Африка 21 36.71067 36.71067 15499,59
    2 Остальное 13 26,87 (0,19) (30,14) (19,68) (3,80) 10 48.66 −0,06 0,19 9124,31
    2 Остальное 9 49,27 (0,95)

    Примечание . Достоверно на уровне значимости 0,05.

    Критерии Группа Этикетка Размер группы Среднее значение Среднее значение т
    Жизнь на улице 1 Африка 10 44.61 0,02 74,76
    2 Остальное 10 44,37 (0,99) (15.51067 (15.51067)
    Грамотный 1 Африка 17 78,77 329,63
    2 72 1067 Остальное 72 Остальное 58 (0,01) (25,00) (15,51) (3,80)
    Девочки 1 Африка 21 36.71067 36.71067 36.71067 110,84
    2 Остальное 13 26,87 (0,19) (30,14) (19,68) (3,80) 10 48.66 -0,06 110,76
    2 Остальное 9 49,27 (0,95) (15,5101072)

    Примечание . Достоверно на уровне значимости 0,05.
    5. Выводы

    В данной статье делается попытка систематического обзора существующей литературы с использованием метаанализа проблем жизнеобеспечения беспризорных детей в разных странах мира и роли социального вмешательства в решении таких проблем.В процессе выполнения метаанализа исследование собрало в общей сложности 158 статей с помощью поиска в Google Scholar и JSTOR. Затем, исходя из этих собранных статей, для этого метаанализа было рассмотрено 31 исследование. Применяя критерии включения и исключения, мы отобрали в общей сложности 31 статью с целью сбора информации об основных характеристиках беспризорных детей (например, демографическом профиле, вариантах средств к существованию, условиях жизни и типах социального вмешательства) с трех континентов ( а именно Африка, Азия и Латинская Америка) мира.Фактически, это 31 исследование охватило 68014 беспризорных детей на трех разных континентах. Данные выборки с этих трех континентов были обработаны, чтобы дать значимое представление о возможностях получения средств к существованию для трех категорий уличных детей (детей, живущих на улице, оставленных на улице и брошенных на улице). Затем данные образца были проанализированы с использованием статистических методов, таких как описательная статистика, отношение шансов и ANOVA. Эмпирические данные, основанные на метаанализе, демонстрируют четкую тенденцию доминирования мужчин в гендерном составе уличных детей.Значительное количество беспризорных детей классифицируются как дети на улице (а не дети улицы или дети, брошенные их семьями), и они работают в качестве поденщиков, чтобы заработать себе на жизнь. Однако результаты ANOVA показывают наличие значительных вариаций внутри группы (т. Е. На континенте) в отношении различных характеристик уличных детей. Интересно, что исследование не подтверждает наличие значительных различий по полу, средствам к существованию и условиям жизни между континентами (т.е., Африка и остальной мир). Однако грамотность наблюдается как исключение, когда между континентами сохраняется значительная разница. Фактически, средний уровень грамотности среди уличных детей в Африке выше по сравнению с остальным миром. Социальное вмешательство в Африке, как документально подтверждено в рассмотренных исследованиях, может значимым образом объяснить различия в уровне грамотности на разных континентах. Таким образом, исследование призывает к активному участию лиц, принимающих решения, и академиков в разработке дорожной карты социального вмешательства для решения проблем беспризорных детей.

    Конкурирующие интересы

    Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

    Узнайте о детях из сладостей Индианаполиса

    Индианаполис известен своими разнообразными сладостями для младенцев, которые в основном являются студентами Университета Индианаполиса. Многие из этих молодых женщин являются сахарными младенцами в Индианаполисе и используют свои учетные записи в различных социальных сетях, таких как Ashley Madison. Если вы уже жили в районе Индианаполиса или поблизости от него, вы, вероятно, слышали об этих красивых и милых очень маленьких творениях.Обычно их называют крольчонками, и они получили всемирное признание через https://www.evernote.com/shard/s688/client/snv?noteGuid=71013714-c614-fd7a-da66-0b2d1c50e0c7&noteKey=b08aaaf774f25683959edtt%3cc&pshd=http://www.evernote=b08aaaf774f25682fa7fd%5cc&html 2F% 2Fwww.evernote.com% 2Fshard% 2Fs688% 2Fsh% 2F71013714-c614-fd7a-da66-0b2d1c50e0c7% 2Fb08aaaf774f25682fa714f5cc959edd3 & title = As% 2Bfind% 2Bmist

    У красивых девушек из Индианаполиса есть такие имена, как Эшли, Белиссима, Лейла и Макайла, плюс они, как говорят, самые популярные пучки меда https: // sweet-daddies.США / Индиана / Блумингтон в Индианаполисе. Вы откроете для себя сотни веб-сайтов, которые обращаются к Indianapolis Sugary Sugar Babies. Отец и мать, которые предоставляют эти минимальные подарки, выбирают их http://demo.lifeandtrendz.com/page/909/ из-за своей идентичности и потому, что это идеальная награда, которую практически любой родитель может дать своему ребенку. Эти дети из Индианы ценят обучение и рост, что делает их такими милыми. Эти младенцы созданы таким образом, чтобы в конечном итоге они были маленькими, и их было легко носить с собой в переноске или, возможно, в сумке.К счастью, они очень универсальны, что делает их очень популярными среди мам, отцов и всех, кто хочет привнести сладость в свой день.

    Многие предприятия начали с признания этих очаровательных младенцев. Все они перечислены во всемирной паутине, и у вас могут быть одни из лучших скидок в Интернете. Вы можете купить сахарного ребенка в сети, если вы этого не сделаете, когда поедете в Индиану, где вы можете попросить их лично позаботиться о них.Есть веб-сайты, которые могут даже отправлять эти типы маленьких творений прямо к порогу, чтобы вы могли сразу начать использовать их все. Потратив немного времени и усилий на свою порцию, вы можете иметь самого сладкого ребенка в вашем образе жизни прямо у вас на коленях.

    Секвенирование всего генома позволяет выявить регуляторные и новые генные варианты детской кардиомиопатии.

    РЕЗЮМЕ

    Кардиомиопатия (CMP) является наследственным генетическим заболеванием. Варианты кодирования белков составляют 20-30% случаев.Вклад вариантов в некодирующие элементы ДНК, которые регулируют экспрессию генов, не исследовался. Мы выполнили полногеномное секвенирование (WGS) 228 неродственных семейств CMP. Помимо патогенных вариантов кодирования белков в известных генах CMP, в 5% случаев наблюдались редкие варианты с потерей функции в новых сердечных генах, причем NRAP и FHOD3 были сильными кандидатами. WGS также выявила высокое бремя вариантов высокого риска в промоторах и энхансерах генов CMP еще в 20% случаев (отношение шансов 2.14, 95% ДИ 1,60-2,86, p = 5,26 × 10 -7 против 1326 контролей) с генами, участвующими в гликозилировании α-дистрогликана ( FKTN, DTNA ) и десмосомной передаче сигналов ( DSC2, DSG2 ), специально обогащенных для регуляторные варианты (коэффициент ложного обнаружения <0,03). Эти результаты были независимо воспроизведены в когорте Genomics England CMP (n = 1266). Функциональное влияние некодирующих вариантов на транскрипцию было функционально подтверждено в анализах миокарда пациента и репортерных исследований в кардиомиоцитах человека, а также в новых вариантах генов при нокаутах у рыбок данио.Наши результаты показывают, что функционально активные варианты в новых генах и в регуляторных элементах генов CMP вносят большой вклад в геномную этиологию CMP с началом в детстве.

    ВВЕДЕНИЕ

    Кардиомиопатия (CMP) — это генетическое заболевание сердечной мышцы с распространенностью от 1: 500 до 1: 2500 в общей популяции (в зависимости от типа CMP). По оценкам, более 20 миллионов человек во всем мире живут с этим заболеванием 1 . Фактическая распространенность, по оценкам, еще выше, учитывая, что у многих пациентов с дефектом гена еще не проявилось заболевание.Только в Северной Америке ежегодно диагностируется несколько тысяч новых случаев БКМ 2 . Более трети случаев передаются по наследству, а остальные носят спорадический характер 3 . Большинство из них являются аутосомно-доминантными по своей природе, вызванными редкими повреждающими вариантами генов, влияющих на структуру и функцию мышц 4,5 . Существует пять фенотипов — гипертрофический (HCM), дилатационный (DCM), рестриктивный (RCM), кардиомиопатия без уплотнения левого желудочка (LVNC) и аритмогенная желудочковая кардиомиопатия (AVC).Заболевание имеет высокую пенетрантность в детстве 6 , при этом БКМ является ведущей причиной сердечной недостаточности и внезапной сердечной смерти у детей 7 . Предполагается, что более серьезная тяжесть заболевания у детей с дебютом БКМП частично связана с генетическими различиями, которые не подвергались систематической оценке 8 .

    Существует значительное генетическое совпадение между различными подтипами CMP. В то время как саркомерные гены, включая MYH7 и MYBPC3 , объясняют ~ 50% всех случаев ГКМП, другие БКМП являются более полигенными, и, несмотря на включение более 100 предполагаемых генов заболевания БКМП в панели клинических диагностических тестов, более 70% БКМП остаются неуловимыми для генов (включая семейные случаи) 9–11 .Отчасти это связано с тем, что стандартные тесты панели генов обычно захватывают только небольшие варианты на уровне последовательности в кодирующих областях известных генов CMP и пропускают участки, трудно поддающиеся секвенированию, большинство событий интронного сплайсинга, структурные изменения и новые гены, не включенные в панели . Важно отметить, что эти тесты не оценивают некодирующий геном, который несет регуляторные последовательности ДНК, включая ядерные и проксимальные промоторы и энхансеры, а также дистальные регуляторные элементы 12 . Эти варианты могут нарушать процесс активации транскрипции с помощью множества механизмов, включая изменения в структуре хроматина, некодирующей РНК, стабильности транскрипта и, что важно, через изменение последовательности ДНК сайтов связывания факторов транскрипции (TFBS).

    Растущее число исследований полногеномного секвенирования (WGS) направлено на выявление новых генетических вариантов при педиатрических и семейных заболеваниях 13–15 . При расстройстве аутистического спектра, сложном генетическом заболевании, WGS позволил идентифицировать предполагаемые некодирующие области как горячие точки для de novo вариантов зародышевой линии 16,17 , новых генов риска-кандидатов 18 , и только обнаружены новые механизмы мутации. по WGS 19,20 . Совсем недавно WGS идентифицировала более высокое содержание de novo вариантов в энхансерах связанных с заболеванием генов у пациентов с врожденными пороками сердца по сравнению с контрольной группой 21 .Однако только 5 из 31 идентифицированного энхансера были связаны с измененными уровнями транскрипции генов-мишеней. По сравнению с ИБС, которая представляет собой сложное заболевание, которое включает не только генетические, но и экологические причины, роль регуляторных вариантов не изучалась при БКМ, в первую очередь генетическом заболевании.

    Здесь мы использовали WGS, чтобы охарактеризовать все классы генетической изменчивости в уникальной и исчерпывающе фенотипированной когорте, установленной для детского начала CMP. WGS идентифицировала 11 новых генов, важных для клинического диагностического тестирования, а также выявила значительно более высокое бремя регуляторных вариантов в генах CMP в 20% случаев по сравнению с контролем, результаты были воспроизведены в независимой когорте CMP.Функция наиболее важных идентифицированных вариантов была подтверждена посредством исследования экспрессии эндогенных генов в миокарде пациента, анализов на основе клеток человека 22,23 и редактирования генов CRISPR у эмбрионов рыбок данио, что обеспечивает парадигму для интерпретации WGS в будущих геномных исследованиях БКМП с детским началом, а также другие генетические нарушения.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Вариант выхода на WGS в когорте открытий

    Когорта открытий состояла из 228 неродственных пробандов моложе 21 года на момент постановки диагноза с первичной БКМ и 69 затронутых и незатронутых членов семьи ( Дополнительная таблица 1 ).Когорта включала 49% DCM, 33% HCM, 7% LVNC, 6% RCM и 3% AVC. 29% случаев имели положительный семейный анамнез БКМП. WGS выполняли на геномной ДНК с использованием платформы Illumina HiSeq X со средним охватом секвенирования 31X (диапазон: 20-50X). Мы опросили 133 гена, представленных в различных коммерческих панелях генов CMP ( Дополнительная таблица 2 ), на предмет редких [популяционная частота минорных аллелей (MAF) <0,01%], прогнозируемого вредного бессмысленности, потери функции (LoF) (сдвиг рамки, временная задержка / stoploss, splicing) и варианты регулирования с высоким риском. На рис. 1a показан рабочий процесс для фильтрации патогенных и вероятных патогенных кодирующих белок однонуклеотидных вариантов (SNV), вставок-делеций (инсерций), вариантов числа копий (CNV) и регуляторных вариантов высокого риска в общей когорте. Варианты, кодирующие белок, были классифицированы как патогенные (включая вероятные патогенные) с использованием критериев Американского колледжа медицинской генетики (ACMG) 17,24–30 . Патогенные белок-кодирующие SNV и инделки в известных генах CMP были обнаружены в 78/228 (34%) случаях, а CNV — в 6/228 (2%) случаях.Только в двух случаях имелись гомозиготные варианты. Еще 20% случаев имели варианты высокого риска в регуляторных элементах генов CMP, а 5% случаев имели вероятные патогенные варианты LoF в новых генах-кандидатах ( Рисунок 1b ). Распределение вариантов по подтипу CMP, по пациентам и по категориям генов показано на рисунках 1c-e .

    Рисунок 1: Количество вариантов, кодирующих белок, и регуляторных вариантов в 228 неродственных случаях БКМ в детском возрасте.

    (a) Блок-схема, показывающая процесс отбора и выход кодирующих белок и регуляторных вариантов в общей когорте и в неуловимой гене подгруппе.36% всех случаев содержали по крайней мере один патогенный кодирующий белок вариант в гене CMP; среди оставшихся 146 неуловимых случаев генов 20% содержали по крайней мере один регуляторный вариант высокого риска в гене CMP; и еще 5% несли вариант LoF в новом гене. ( b ) Круговая диаграмма, показывающая распределение кодирующих белок и регуляторных вариантов в генах CMP и вариантов LoF в новых генах в когорте (n = 228). WGS выявила предположительно причинные белок-кодирующие SNV / indels / CNV в генах CMP в 36% случаев, варианты высокого риска в регуляторных элементах генов CMP в дополнительных 20% случаев и варианты потери функции (LoF) в новых генах в еще 5% случаев.( c ) Распределение вариантов по подтипам CMP: случаи HCM имели более высокий выход вариантов, кодирующих патогенный белок, по сравнению с другими подтипами CMP (OR 3,14, CI 1,77-5,57, p = 1,22 × 10 -4 ). ( d ) Вариантное бремя для пациента в когорте: 11 случаев (5%) имели несколько вариантов кодирования белка в известных генах CMP, 10 случаев (4%) имели несколько вариантов регуляции и 23 случая (10%) имели оба варианта. белковые кодирующие и регуляторные варианты в генах CMP. ( e ) Распределение вариантов по функциональным категориям генов: из всех патогенных вариантов, кодирующих белок, 64% относились к саркомерным генам, которые представляли значительное обогащение по сравнению с другими категориями генов (биномиальный p = 3.16 × 10 −49 ). Напротив, ни один из регуляторных вариантов высокого риска не был в саркомерных генах.

    БКМП, кардиомиопатия; SNV, однонуклеотидный вариант; CNV, вариант номера копии; gnomAD, База данных агрегирования генома; ACMG, Американский колледж медицинской генетики; TFBS, сайт связывания фактора транскрипции; P / LP, патогенные или вероятные патогенные; LoF, потеря функции; HCM, гипертрофическая кардиомиопатия; ДКМП, дилатационная кардиомиопатия;

    Варианты кодирования белков в известных генах CMP

    SNV и CNV, кодирующие белок, описаны в дополнительных таблицах 3 и 4 .Большинство (64%) вариантов, кодирующих патогенный белок, относились к саркомерным генам, которые представляли собой значительное обогащение по сравнению с другими категориями генов (бином р = 3,16 × 10 -49 ). Случаи HCM имели более высокий выход вариантов патогенного кодирования белка по сравнению с другими подтипами CMP с отношением шансов (OR) 3,14, 95% доверительным интервалом (CI) 1,77-5,57 (p = 1,22 × 10 -4 ). Следует отметить, что WGS обнаружила патогенные варианты кодирования белков в 17/228 (7,5%) случаях, ранее пропущенных панельным клиническим генетическим тестированием, поскольку не все гены CMP улавливаются коммерческими группами тестирования, и ни одна из генных панелей не исследует CNV 31 .

    Влияние вариантов, кодирующих белок, на экспрессию генов-мишеней в миокарде

    Уникальной особенностью нашего биобанка является доступ к образцам миокарда от пациентов, перенесших операцию или трансплантацию сердца. Секвенирование РНК было выполнено в образцах миокарда LV от 35 пациентов с секвенированным CMP, чтобы подтвердить влияние SNV и CNV LoF на экспрессию генов. Рисунок 2a-c показывает, что экспрессия мРНК гена-кандидата была ниже 25 -го перцентиля в миокарде пациентов, несущих SNV LoF ( DSC2, FLNC, MYBPC3 ), по сравнению с остальной когортой.Уровни экспрессии эндогенных генов также были снижены у пациентов с однокопийными CNV с делециями, влияющими как на промотор, так и на первые экзоны генов JPh3 и NEXN , а также экзон 11 из CTNNA3 ( рис. 2d-f ). Возможность показать влияние вариантов кодирования на экспрессию эндогенных генов в органе-мишени является уникальным открытием, которое поддерживает использование миокарда пациента для проверки патогенности вариантов.

    Рисунок 2: Эффект потери функции и делеции числа копий в генах CMP на экспрессию генов миокарда.

    На рисунке показана экспрессия гена миокарда LV с использованием секвенирования РНК у пациента с потерей функции или удалением числа копий (красная точка) по сравнению с другими случаями без варианта (серые точки) (n = 35 случаев). ( ac ) На левых панелях показано аминокислотное положение трех вариантов патогенной потери функции в DSC2 (остановка), FLNC (акцептор сплайсинга), MYBPC3 (делеция сдвига рамки считывания), которые, по прогнозам, приведут к бессмысленному распаду. мРНК. На правых панелях показана масштабированная экспрессия целевой мРНК RPKM ниже 25 -го перцентиля по сравнению с остальной когортой; ( d-f ) На левой панели показано геномное расположение трех одиночных делеций CNV в генах CTNNA3, JPh3, NEXN .На правых панелях показана масштабированная экспрессия целевой мРНК RPKM до уровня ниже 25 -го процентиля по сравнению с остальной когортой.

    RPKM, считываний на килобазу транскрипта, на миллион отображенных считываний

    Варианты LoF, кодирующие белок в новых генах CMP

    WGS предоставили нам возможность исследовать новые биологически релевантные гены, помимо известных генов CMP, в качестве потенциальных источников патогенных вариантов кодирования . Мы провели поиск редких (gnomAD MAF <0,01%) предсказанных вредных гетерозиготных и гомозиготных вариантов LoF в генах, участвующих в сердечной функции с умеренно-высокой экспрессией сердца, которые, как считалось, ограничены для вариантов LoF 32,33 .Используя эти критерии, мы идентифицировали редкие варианты LoF в 11 новых генах у пациентов с CMP, которые не имели патогенного кодирующего белок варианта (5% когорты) ( Дополнительная таблица 5 ). Изучение 1266 независимых пробандов CMP в репликационной когорте 100000 Genomes Project выявило редкие гетерозиготные или гомозиготные варианты LoF в пяти из этих новых генов ( FHOD3, NRAP, PDE4DIP, PTGDS и TRPM4 ). FHOD3 содержал самую высокую долю вариантов LoF, с вариантами, идентифицированными в пяти дополнительных случаях CMP из проекта 100 000 Genomes Project, в отличие от только одного контрольного образца ICGC.

    Из этих 11 генов мы исследовали FHOD3 и NRAP в качестве сильных кандидатов, поскольку известно, что они обладают высокой сердечно-специфической экспрессией 34,35 , важны для поддержания саркомерного и актинового цитоскелета в сердце. , и были связаны с CMP в исследованиях на мышах и в небольших сериях случаев 36–43 . В нашей когорте мы обнаружили редкий вариант со сдвигом рамки в FHOD3 у пациента с DCM и редкий гомозиготный вариант со сдвигом рамки в NRAP у пациента с DCM, рожденным от кровных родственников.Интересно, что делеция FHOD3 со сдвигом рамки в chr18: 36652786, наблюдаемая в нашей когорте, также была обнаружена в случае из проекта 100000 геномов ( Дополнительная таблица 6 ). Распределение вариантов LoF в NRAP показано на Рис. 3a и FHOD3 на Рис. 3b для когорты обнаружения, когорты репликации проекта 100 000 геномов и gnomAD. Используя миокард ЛЖ пациента с вариантом NRAP , мы подтвердили, что экспрессия мРНК NRAP (с использованием RNAseq и целевой qRT-PCR) и экспрессия белка (на вестерн-блоттинге) значительно подавлялись у пациента, у которого был вариант, по сравнению с другими. Пациенты с CMP, у которых не было этого варианта (, рис. 3c, ).

    Рисунок 3: Варианты потери функции в новых генах CMP:

    Местоположение вариантов потери функции в ( a ) NRAP (ENST00000359988) и ( b ) FHOD3 (ENST000005

    ) в 228 случаях CMP в когорта открытия (оранжевые точки) и в 1326 случаях CMP в когорте репликации проекта 100 000 Genomes Project (синие точки). Фоновая карта плотности вариантов gnomAD показана серым цветом. ( c ) Экспрессия NRAP в миокарде: анализ РНК-seq продемонстрировал низкую экспрессию мРНК NRAP (<75 -го процентиля) в миокарде ЛЖ пациента с DCM, имеющего гомозиготный вариант со сдвигом рамки считывания (chr10: 115401188_T / TAGC (красная точка) по сравнению с 34 пациентами с ХМП без варианта (черные точки).График показывает медианное выражение для когорты, 25 -го и 75 -го процентилей, а также нижние и верхние предельные значения. qRT-PCR подтвердила снижение экспрессии мРНК NRAP у пациентов с вариантом по сравнению с 2 пациентами с CMP без варианта, то есть WT (* p <0,05 по сравнению с WT). Вестерн-блоттинг подтвердил подавление экспрессии белка NRAP у пациента с вариантом по сравнению с 3 пациентами с CMP без варианта на репрезентативных изображениях вестерн-блоттинга (* p <0.05 против WT). ( d-g ) Эмбрионы рыбок данио Эмбрионы рыбок данио на стадии 1 клетки инъецировали 4 комплексами направляющих РНК CRISPR-Cas9, чтобы вызвать нокаут 2 генов, nrap и fhod3ab . ( d ) qRT-PCR показала подавление экспрессии целевой мРНК на 35-49% в объединенных образцах мутантов nrap и fhod3ab по сравнению с контролями WT и контролями только Cas9 (n = 3 независимых повтора на ген) (* * p <0,01 по сравнению с контролем). ( e ) 22% мутантов nrap и 26% мутантов fhod3ab показали аномальный сердечный фенотип по сравнению с 0% в контроле только с Cas9 (** p <0.01 по сравнению с элементами управления). ( f ) Конечная систолическая площадь предсердий была выше, а конечная диастолическая зона желудочков была ниже у мутантов nrap и fhod3ab по сравнению с контролем только WT и Cas9 (** p <0,01 по сравнению с контролем). ( г ) Типичные изображения фазового контраста трансгенных myl7 : эмбрионов GFP, показывающих кардиомегалию, дилатацию предсердий и ограничение желудочков у мутантных эмбрионов по сравнению с контрольными эмбрионами дикого типа или только Cas9. (** р <0,01 по сравнению с контролем). Масштабная линейка = 50 мкм.Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов на образец, причем каждый эксперимент включает 3 технических повтора.

    gnomAD, База данных агрегирования генома; WT, дикий тип; mut, мутант

    Эффект нокаута CRISPR-Cas9 новых генов у рыбок данио

    Чтобы подтвердить роль этих новых генов в структуре и функции сердца in vivo , мы индуцировали направленный нокаут nrap и fhod3 у рыбок данио эмбрионы путем инъекции в желточный мешок наборов из 4 комплексов управляющей РНК (gRNA) CRISPR-Cas9, которые избыточно нацелены на один ген и вызывают эффективный нокаут, что позволяет быстро провести скрининг функции гена 44,45 ( Рисунок 3d-g) .Секвенирование по Сэнгеру выявило большое количество вариантов с высокой эффективностью разрезания 4 гРНК, нацеленных на экзоны nrap, fhod3a и fhod3b по сравнению с 0% в контроле только Cas9 ( Supplementary Figure 1) . qRT-PCR показала 0,64-кратное подавление nrap и 0,4-кратное подавление fhod3a и fhod3b в эмбрионах, отредактированных CRISPR-Cas9, по сравнению с контрольными ( Рисунок 3d ). Фенотипический анализ выявил значительное увеличение предсердий у генетически отредактированных эмбрионов по сравнению с контрольными эмбрионами дикого типа или только Cas9 (p <0.01 по сравнению с контролями для всех генов) ( Рисунок 3e ). Конечная диастолическая площадь желудочков была значительно снижена у генетически отредактированных эмбрионов по сравнению с контрольными эмбрионами дикого типа или Cas9 (, рис. 3f-g ), но фракция выброса желудочков была сохранена (дикий тип 36 ± 2%, Cas9 34 ± 4%, ). мутанты nrap 37 ± 3% и fhod3ab , мутанты 42 ± 2%), что указывает на рестриктивный фенотип CMP у эмбрионов с дефектами nrap и fhod3 . Вместе эти исследования подтверждают роль вариантов LoF в новых генах, таких как NRAP и FHOD3 , в возникновении CMP.

    Регуляторные варианты генов CMP

    Мы создали атлас функционально активных регуляторных элементов сердечных экспрессируемых генов по всему геному. Это было сделано путем картирования некодирующих областей в сердце человека, которые предположительно регулируют транскрипцию кардиоактивных генов на основе экспериментальных данных, собранных из связанных с сердцем эпигенетических, ДНКазных и гистоновых данных ChIP-seq, депонированных в ENCODE и других базах данных 46 –49 . Мы определили промоторные области генов CMP путем слияния пиков ДНКазы-seq открытого хроматина и гистоновых меток, специфичных для промоторов и энхансеров в сердечных тканях.Там, где эта информация была недоступна, мы определили промоторные области как 1,5 т.п.н. выше и 1 т.п.н. от сайта начала транскрипции (TSS). В этом исследовании мы сосредоточились на промоторах и энхансерах известных генов CMP, а не на всем геноме, чтобы избежать ложноположительных результатов, связанных с генами с неясной ассоциацией с CMP. Мы сопоставили SNV с активными регуляторными регионами и определили их как уровень 1, если они были редкими, то есть MAF <0,01% в популяционном контроле, и было предсказано изменение связывания фактора транскрипции (TF) по крайней мере с помощью 3 из 4 инструментов прогнозирования, которые предсказывают, Изменение последовательности влияет на вероятные эффекты TFBS или хроматина с однонуклеотидной чувствительностью 50–53 (см. Методы).

    Мы дополнительно отдали приоритет вариантам, которые имели по крайней мере 1,3-кратное обогащение в случаях по сравнению с контролем, которые были в регуляторных элементах, активных в левом желудочке (LV) человека, и которые наблюдались в случаях, неуловимых генами (т.е. кодирующие варианты в генах CMP). Это предоставило окончательный список приоритетных 52 вариантов уровня 1 с высоким уровнем риска в 19% когорты (, рис. 4a, ). Два дополнительных пациента имели CNV высокого риска в регуляторных элементах BAG3 и TGFB3 (дополнительная таблица 4) .Для анализа бремени случай-контроль мы использовали данные WGS от 1326 больных раком без сердечных заболеваний из Международного консорциума генома рака (ICGC) 54 . Это подтвердило обогащение регуляторных вариантов генами CMP в случаях по сравнению с контролем (OR 2,14, 95% CI 1,60–2,86, p = 5,26 × 10 -7 ) ( Рисунок 4b ). Дополнительная таблица 7 предоставляет подробную информацию о вариантах регулирования с высоким уровнем риска. Четыре главных гена, значительно обогащенных регуляторными вариантами, были в путях, связанных с (i) гликозилированием α-дистрогликана, важным для структуры саркомера i.е. FKTN (OR 53.2, CI 2.9-991) и DTNA (OR 5.6, CI 2.5-12.5), и (ii) десмосомная сигнализация, т.е. DSC2 (OR 29.3, CI 1.4-611) и DSG2 (OR 9.7, CI 1.2-74) ( Рисунок 4c ). Ни один из вариантов не был de novo среди пробандов с полными данными по трио. Дополнительные варианты-кандидаты уровня 1 в этих и других генах, важных в этих двух сигнальных системах, также описаны в таблице, хотя они не соответствуют всем критериям высокого риска.

    Рис. 4. Бремя нормативных вариантов в случаях (n = 228) и контроле (n = 1326).

    ( a ) Бремя регуляторных вариантов уровня 1 в генах CMP в случаях (оранжевый) и контроле (синий). Наблюдалось значительное обогащение регуляторных вариантов уровня 1 в случаях по сравнению с контролем (OR 2,14, 95% ДИ 1,60–2,86, p = 5,26 × 10 −7 ). ( b ) Бремя регуляторных вариантов уровня 1 генами в случаях в когорте обнаружения по сравнению с контролем. Четыре лучших гена, обогащенных регуляторными вариантами по сравнению с контролем, включали FKTN (OR = 53.2, CI = 2.9-991), DTNA (OR = 5.6, CI = 2.5-12.5), DSC2 (OR 29.3, CI 1.4-611) и DSG2 (OR 9.7, CI 1.2-74). ( c ) Когорта репликации (n = 1266): точечная диаграмма показала положительную корреляцию между генами, обогащенными регуляторными вариантами высокого риска в когорте обнаруженных CMP, и когорте репликации проекта 100000 Genomes (Spearman ρ 2 0,737, p = 1,02 × 10 −8 ), причем верхние гены сходны в обеих когортах CMP ( FKTN, DTNA, DSC2, DSG2 )

    OR, отношение шансов

    Мы расширили наш анализ на независимую репликационную когорту из 1266 CMP. Пробанды с данными WGS из проекта 100,000 Genomes Project.Наблюдалась положительная корреляция между когортами открытия и репликации для генов, обогащенных регуляторными вариантами высокого риска (Spearman ρ 2 0,737, p = 1,02 × 10 -8 ), причем верхние гены были сходными в обеих когортах CMP ( FKTN, DTNA, DSC2, DSG2 ) с OR в диапазоне от 3,14 до 13,7 (, рисунок 4d, ).

    Анализ обогащения путей

    Сравнение путей, обогащенных кодирующими белками, с регуляторными вариантами было выполнено с использованием баз данных Gene Ontology и Reactome 55–57 .Варианты, кодирующие патогенный белок, были обогащены узким набором категорий генов, непосредственно связанных с сокращением мышц, включая связывание актина, тропонина С, кальмодулина и протеинкиназы (, дополнительный рисунок 2a, ). Напротив, регуляторные варианты высокого риска были обогащены не только генами, участвующими в процессах, связанных с сокращением мышц, но также и дополнительными разнообразными путями, связанными с передачей сигналов ERK / Ras, передачей сигналов рецептора фактора роста фибробластов и передачей сигналов тирозинкиназы ( Дополнительный рисунок 2b). ).В отличие от вариантов, кодирующих белок, ни один из регуляторных вариантов высокого риска не был в саркомерных генах. Было только шесть генов ( DSC2, DSG2, JPh3, LAMP2, NEXN, PRKAG2 ), которые несли варианты высокого риска как в кодирующей, так и в регуляторной областях.

    Следует отметить, что высокая доля, то есть 44 (19%) случаев, содержала множественные кодирующие и / или регуляторные варианты в известных генах CMP, включая 5% с множественными вариантами кодирования белка, 4% с множественными вариантами регуляции и 10% с комбинация обоих типов вариантов ( Рисунок 1d ).Множественные варианты у трети пациентов были в генах, важных для архитектуры миокарда, то есть саркомерных, цитоскелетных, десмосомных и других структурных генах. Множественные варианты были более распространены в случаях HCM по сравнению с другими подтипами CMP (OR = 3,4, CI = 1,7-6,6, p = 5,75 × 10 -4 ).

    Функциональная оценка регуляторных вариантов

    Мы отдали приоритет регуляторным вариантам уровня 1 в 6 генах ( BRAF, DSP, DTNA, FKRP, FKTN, LARGE1, PRKAG2, TGFB3) для функционального анализа, основанного на доступности левого желудочка (LV) миокард от вариантно-положительных пациентов. На рис. 5 показаны регуляторные варианты с высоким риском, идентифицированные в этих восьми генах в нашей когорте открытий и в когорте 100000 Genomes Project, наложенные на фон частотного распределения в эталонной популяции 33 Базы данных геномной агрегации (gnomAD). Большинство регуляторных локусов лишены вариантов в gnomAD, что указывает на сильно ограниченные локусы. Дополнительная фигура 3 показывает изменение одного нуклеотида в варианте, представляющем интерес в нашей когорте открытий, по сравнению с последовательностью дикого типа и прогнозируемым эффектом на мотивы связывания TF 58 .

    Рисунок 5: Геномное расположение вариантов в регуляторных элементах генов, приоритетных для функциональных исследований.

    На рисунках показаны геномные координаты SNV в когорте открытия (n = 228, оранжевые точки) и когорте репликации проекта 100000 Genomes Project (n = 1266, синие точки), отображенные относительно первой (P1) области промотора и сайта начала транскрипции для следующих генов ( a ) BRAF , ( b ) DSP , ( c ) DTNA , ( d ) FKRP , ( e ) FKTN , ( f ) LARGE1 , и в области усилителя для ( g ) PRKAG2 (E15) и ( h ) TGFB3 (E1).SNV, наблюдаемые в эталонных образцах gnomAD, отображаются в виде кривых плотности серого цвета по всему региону. Все регуляторные варианты наблюдались с частотой аллелей <0,01% в наборе данных gnomAD и имели тенденцию к кластеризации в регионах, которые были истощены для вариантов в gnomAD. Координаты основаны на эталонном геноме hg19.

    gnomAD, База данных агрегирования генома

    Ассоциация регуляторных вариантов с экспрессией миокардиального гена

    Способность показать изменение экспрессии миокардиального гена является важным доказательством влияния регуляторных вариантов на транскрипцию эндогенных генов.Экспрессию мРНК и белка измеряли с помощью RNAseq, qRT-PCR и Western blot или иммуногистохимии у 35 пациентов, у которых был доступен миокард LV. Экспрессию миокарда сравнивали у пациента, у которого был вариант, с контролем без CMP или у пациентов с CMP, не несущих вариант.

    Мы оценили варианты промоторов в BRAF, DSP, FKTN и LARGE1 проксимальнее соответствующего TSS, которые, как предполагалось, изменяют связывание TF. По сравнению с контрольной группой и / или пациентами с отрицательным вариантом CMP, мРНК BRAF показала 0.76-кратное подавление qRT-PCR у пациента, несущего вариант промотора (chr7: 140624223_G / A) ( Рисунок 6a, ). Вариант DSP (chr6: 7541776_G / A) был связан с более высокой экспрессией в миокарде DSP как на РНК-seq (выше 75 -го процентиля для когорты), так и на qRT-PCR (1,6-кратное усиление) ( Рисунок 6b ). Вариант промотора FKTN (chr9: 108320330_G / A) был связан с более низкой экспрессией FKTN у пациента RCM на RNAseq, на qRT-PCR (0.5-кратное подавление) и Вестерн-блоттинг (0,24-кратное подавление) ( Рисунок 6c, ). У пациента с HCM, несущего вариант промотора LARGE1 (chr22: 34316416_C / T), иммуногистохимия показала снижение экспрессии периъядерного белка LARGE1 у пациента по сравнению с контролем ( Рисунок 6d ). Вариант энхансера PRKAG2 (chr7: 1513

    _A / C), обнаруженный у пациента с DCM, был связан с 1,4-кратной активацией на qRT-PCR и 1,5-кратной активацией на вестерн-блоте в миокарде пациента ( Рисунок 6e ).Экспрессия TGFB3 в миокарде у пациента с RCM с вариантом усилителя высокого риска (chr14: 76289218_A / G), предположительно взаимодействующим с промотором TGFB3 48 , была связана с более высокой экспрессией мРНК на RNA-seq, 4,2-кратной активацией мРНК при qRT-PCR и 1,5-кратная повышающая регуляция белка TGFB3 при вестерн-блоттинге по сравнению с контролем (, рисунок 6f, ). Эти данные, полученные непосредственно из миокарда пациентов, несущих интересующие варианты, подтвердили, что SNV в ключевых регуляторных элементах связаны с важным влиянием на функциональные генные продукты и предоставляют важные подтверждающие доказательства патогенности вариантов.

    Рисунок 6: Экспрессия целевого гена и белка в миокарде ЛЖ пациентов, несущих регуляторные варианты.

    RNA Seq, qRT-PCR, Western blot и иммуногистохимия были выполнены в доступном миокарде LV от пациентов с CMP (n = 35) для выявления экспрессии мРНК и белков целевых генов у пациентов, несущих регуляторные варианты в BRAF, DSP, FKTN, LARGE1 , ПРКАГ2 или ТГФБ3 . Для данных секвенирования РНК, целевую масштабированную экспрессию гена RPKM сравнивали между пациентом, у которого был вариант (красная точка), и остальной частью когорты (черные точки) с использованием прямоугольных диаграмм, показывающих медианную экспрессию для когорты, 25 th и 75 th процентилей, а также максимальные и минимальные значения (n = 35).Для кОТ-ПЦР, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии экспрессия целевого гена или белка в миокарде ЛЖ пациента, несущего этот вариант, сравнивалась с контролем дикого типа, включая образец аутопсии от человека без сердечного заболевания, а также один или несколько CMP пациенты, которые не имели каких-либо известных патогенных кодов или вариантов регуляции. Для каждого образца было проведено три независимых эксперимента, каждый из которых включал три технических повтора для каждого образца. Уровень экспрессии белка GAPDH в качестве гена домашнего хозяйства использовали в качестве контроля загрузки для вестерн-блоттинга.Планки погрешностей указывают стандартное отклонение между средними значениями каждого независимого эксперимента. ( a ) BRAF : вариант промотора chr7: 140624223_G / A был связан с нормальной экспрессией мРНК BRAF на RNAseq, но снижал экспрессию мРНК BRAF при qRT-PCR. Вариант промотора chr7: 140624286_C / T был связан с повышенной экспрессией мРНК на RNAseq (> 75 th процентиль). ( b ) DSP : вариант промотора (chr6: 7541776_G / A) был связан с повышенной экспрессией мРНК DSP на RNAseq (> 75 th процентиль) и на qRT-PCR (* p <0.05 по сравнению с элементами управления). ( c ) FKTN : вариант промотора 1 (chr9: 108320330_G / A) был связан со сниженной экспрессией мРНК FKTN на RNAseq (<75 th процентиль), сниженной экспрессией мРНК на qRT-PCR (p <0,05 по сравнению с контролями), снижение экспрессии белка на репрезентативных изображениях вестерн-блоттинга и снижение относительного содержания белка при количественной оценке (* p <0,05 по сравнению с контролями). ( d ) LARGE1 : Вариант промотора chr22: 34316416_C / T был связан с более низким перинуклеарным окрашиванием LARGE1 (коричневый) (ядерное окрашивание, синий) на репрезентативных иммуногистохимических изображениях и более низким% LARGE1-положительных клеток в миокарде пациента (* р <0.05 по сравнению с элементами управления). Ткань тимуса использовалась в качестве отрицательного контроля. Шкала шкалы = 20 мкм. ( e ) PRKAG2 : вариант энхансера chr7: 1513

    _A / C был связан с нормальной экспрессией мРНК PRKAG2 на RNAseq, но более высокой экспрессией мРНК на qRT-PCR (* p <0,05 по сравнению с контролем), более высокой экспрессией белка на Western репрезентативные изображения блотов и более высокая относительная экспрессия белка при количественной оценке (* p <0,05 по сравнению с контролями). ( f ) TGFB3 : вариант энхансера (chr14: 76289218_A / G) был связан с более высокой экспрессией мРНК TGFB3 на RNAseq, более высокой экспрессией мРНК на qRT-PCR (* p <0.05 по сравнению с контролями), более высокая экспрессия белка на репрезентативных изображениях вестерн-блоттинга и более высокое относительное содержание белка при количественной оценке (* p <0,05 по сравнению с контролями).

    RNA Seq, секвенирование РНК; WT, дикого типа

    Влияние регуляторных вариантов на транскрипцию гена с использованием репортерных анализов
    Репортерный анализ люциферазы

    Генные промоторы или энхансер + промоторы, несущие кандидатные SNV и соответствующую контрольную область, клонировали в репортеры люциферазы светлячка и трансфицировали в индуцированный человеком плюрипотент Кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (ИПСК), для определения влияния вариантов на транскрипционную активность репортерного гена люциферазы (, дополнительная фигура 4a, ).Клонированные варианты промотора BRAF (chr7: 140624223_G / A), DTNA (chr18: 32072866_A / G), FKRP (chr19: 47249754_C / T), FKTN_A 3, chr9r9: 108320330_G / A) и LARGE1 (chr22: 34316416_C / T) снижали активность люциферазы по сравнению с контрольными последовательностями. Вариант промотора DSP ( chr6: 7541776_G / A ) , второй вариант промотора LARGE1 ( chr22: 34316687_G / A ) и вариант энхансера TGFB3 (chr14 / G14: 7628) значительно повышенная активность люциферазы по сравнению с контрольными последовательностями (, фиг. 7a, ).Измененная регуляция транскрипции репортера люциферазы путем встраивания вариантов промотора и энхансера нескольких генов CMP предполагает прямой регуляторный эффект этих SNP на транскрипцию целевого гена.

    Фигура 7: Репортерные анализы в человеческих ИПСК-кардиомиоцитах.

    ( a ) Репортерный анализ люциферазы, показывающий влияние регуляторных вариантов на транскрипцию. Клонированные варианты промотора BRAF (chr7: 140624223_G / A), DTNA (chr18: 32072866_A / G), FKRP (chr19: 47249754_C / T), FKTN_A 3, chr9r9: 108320330_G / A) и LARGE1 (chr22: 34316416_C / T) снижали активность люциферазы по сравнению с контрольными последовательностями.Вариант промотора DSP ( chr6: 7541776_G / A ) , второй вариант промотора LARGE1 ( chr22: 34316687_G / A ) и вариант энхансера TGFB3 (chr14 / G14: 7628) значительно повышенная активность люциферазы по сравнению с контрольными последовательностями. * p <0,05 по сравнению с контрольной последовательностью. Все анализы люциферазного репортера проводили с 3 биологическими повторами, каждый с 3 техническими повторами. ( b ) График вулкана, представляющий влияние 54 регуляторных вариантов на экспрессию генов с использованием MPRA.29 вариантов имели значительные различия в транскрипционной активности между референсным и альтернативным аллелями (FDR <0,05, представлен горизонтальной черной линией). Серый = активность варианта CMP ниже, чем у референсного аллеля; черный = активность варианта CMP выше, чем референсный аллель. ( c ) 66% значимых вариантов были связаны с более высокой транскрипционной активностью референсного аллеля. ( d ) Log2-кратные изменения транскрипционной активности между альтернативными и референсными аллельными последовательностями.( e ) Репрезентативные графики подсчета MPRA альтернативного аллеля (зеленый) по сравнению с последовательностями референсных аллелей (серый) BRAF (chr7: 140624223_G / A), DSP (chr6: 7541468_T / C) и DTNA (chr18: 32073296_C / G). Все анализы MPRA проводили в 5 независимых биологических повторностях.

    MPRA, массово-параллельный репортерный анализ; ref seq, эталонная аллельная последовательность; FDR, ложное обнаружение; CMP, кардиомиопатия

    Массивно-параллельный репортерный анализ (MPRA)

    Для оценки функционального эффекта дополнительных регуляторных вариантов уровня 1 на транскрипционную активность мы использовали MPRA с более высокой пропускной способностью в кардиомиоцитах 22,23 .В частности, мы протестировали регуляторные эффекты 54 вариантов путем анализа транскрипционной активности их референсных и альтернативных аллелей (каждый аллель представлен 25 уникальными штрих-кодами, см. Методы) в iPSC-кардиомиоцитах PGP17 (n = 5 независимых повторов) ( Дополнительный рисунок 4b). -e, Дополнительная таблица 8 ). Из 54 исследованных вариантов 29 вариантов (54%) показали значительные транскрипционные различия между двумя аллелями [коэффициент ложного обнаружения (FDR) <0,05] ( рис. 7b , c ) с изменением в 2 раза в диапазоне от -2.72 до +2,23 ( Рисунок 7d, Дополнительная таблица 8 ). Это представляло 26 дополнительных вариантов с высокой регуляторной активностью помимо тех, которые были подтверждены в предыдущих анализах репортера миокарда и люциферазы. Репрезентативные примеры подсчета MPRA показывают высокую регуляторную активность вариантов в локусах BRAF, DSP и DTNA ( Рисунок 7e ). В целом, результаты MPRA подтверждают, что наша WGS уверенно идентифицировала варианты, которые функционально активны в кардиомиоцитах.

    Таким образом, наши результаты с использованием WGS выявили значительный вклад регуляторных вариантов и CNV в генах CMP (в 20% случаев) и небольшой, но заметный вклад вариантов, кодирующих белок LoF в новых генах (еще в 5% случаев). случаев) с началом CMP в детстве.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    WGS дает большое количество вариантов, кодирующих и регулирующих белок зародышевой линии. Пониманию их вклада в болезнь человека мешает отсутствие строгих биоинформатических и функциональных подходов, адаптированных к изучаемому заболеванию.Используя WGS в CMP, мы выявили вредоносные варианты кодирования белков у 36% нашей когорты, включая 7,5%, которые были пропущены, несмотря на клинические испытания генов-кандидатов. Более того, мы обнаружили 5% пациентов с вредными вариантами в новых генах CMP и, что очень важно, еще у 20% пациентов с регуляторными вариантами высокого риска, о которых ранее не сообщалось в CMP. Было подтверждено, что важное подмножество этих регуляторных вариантов влияет на экспрессию экзогенных и эндогенных генов в функциональных анализах, тем самым обеспечивая убедительные доказательства их вклада в CMP.Обнаружение и проверка этих новых вариантов снизили вдвое количество неуловимых генов случаев БКМ в нашей когорте.

    Из новых генов, содержащих вредоносные варианты кодирования белков, два гена, NRAP и FHOD3 , оказались сильными кандидатами. Оба важны для поддержания саркомерного и актинового цитоскелета в сердце и были связаны с CMP в исследованиях на мышах и небольших сериях случаев 36–43,59,60 . Наш пробанд был гомозиготным по варианту LoF в NRAP , как и ранее описанная семья с аутосомно-рецессивным фенотипом DCM 39 .Более того, в нашей репликационной когорте также было обнаружено большое количество вариантов этих генов. Сниженная экспрессия NRAP в миокарде пациента в сочетании с данными о сниженной экспрессии nrap и fhod3 и фенотипом CMP у рыбок данио подтверждают доказательства того, что NRAP и FHOD3 являются новыми генами, которые следует рассматривать как сильные гены-кандидаты для клинических испытаний при ХМП.

    Чрезвычайно захватывающим открытием нашего исследования было обогащение высокоэффективных регуляторных SNV и CNV в случаях по сравнению с контролем, при этом 20% случаев несли эти варианты в рекуррентно мутировавших областях, активных в LV человека.При анализе по подтипу CMP, выход регуляторных вариантов с высоким риском был выше у CMP без HCM, в которых варианты, кодирующие белок, составляют лишь небольшую часть случаев. В целом, регуляторные варианты были обогащены не только путями, связанными с сокращением мышц, но также связыванием α-дистрогликана, десмосомной передачей сигналов и передачей сигналов ERK / Ras. Хотя кодирующие варианты в этих путях обычно вызывают мультисистемное вовлечение, мы не наблюдали системных особенностей у пациентов, несущих некодирующие варианты этих генов.Возможно, что действие регуляторных вариантов ограничено сердцем, в отличие от кодирующих вариантов, которые влияют на функцию белка во многих тканях. Кроме того, саркомерные гены менее подвержены влиянию регуляторных вариантов, вероятно, потому, что они более толерантны к гапло-недостаточности.

    Известный набор генов с дисрегулируемой экспрессией включал DTNA, FKTN, FKRP, LARGE1 и POMT , которые необходимы для функции α-дистрогликана посредством посттрансляционного гликозилирования.Дистрогликан является центральным компонентом комплекса дистрофин-гликопротеин, где он действует как трансмембранный линкер, прикрепляя цитоскелет к внеклеточному матриксу и играет роль в стабильности миоцитов, сарколеммы и саркомеров 61,62 . Нарушение гликозилирования было связано с тяжелой сердечной дисфункцией у FKTN или LARGE1-дефицитных мышей и с DCM (с легким или отсутствующим вовлечением скелетных мышц) часто в контексте гомозиготных или сложных гетерозиготных вариантов 63–65 .Мы также обнаружили обогащение регуляторных вариантов, нарушающих экспрессию десмосомных генов ( DSG2, DSC2, JUP, DSP ), в которых, как сообщалось, оба варианта missense и LoF вызывали AVC, DCM и RCM, аналогично пациентам в нашей когорте 66 .

    Сильной стороной нашего исследования была возможность функционально проверить влияние регуляторных вариантов на экспрессию генов и белков. Мы подтвердили, что активность репортерного гена люциферазы изменялась под действием вариантных последовательностей промотора / энхансера по сравнению с контролем дикого типа в кардиомиоцитах человека 67,68 .Мы признаем, что анализы репортера люциферазы не в состоянии оценить регуляторные варианты, которые влияют на структуру хроматина. Однако мы определили промоторы генов CMP путем слияния пиков ДНКазы-seq открытого хроматина и гистоновых меток, специфичных для промоторов и энхансеров, полученных из сердечной ткани. Более того, мы смогли показать, что экспрессия эндогенных генов была изменена в миокарде ЛЖ пациентов, несущих эти варианты, что поистине уникальное преимущество нашего исследования. Например, повышенная регуляция TGFB3 в миокарде наблюдалась у пациентов с DCM или HCM, но это первый случай, когда вариант регуляторного элемента этого гена связан с повышенной экспрессией TGFB3 в миокарде пациента 69,70 .Сходным образом, насколько нам известно, это первое сообщение о сниженной экспрессии целевого гена в миокарде пациентов, несущих варианты промотора Tier 1, а также тех, у кого есть CNVs, включающие гены-кандидаты CMP 71–74 . Важно отметить, что с помощью MPRA мы смогли продемонстрировать значительный регуляторный эффект большего подмножества вариантов с высоким риском, связанных с этими генами, усиливая силу нашей стратегии выбора вариантов 75–78 . Вместе эти находки не только представляют собой важный прогресс в нашем понимании сердечной регуляции, но также предоставляют новое понимание геномной архитектуры детского CMP и добавляют к открытию некодирующих вариантов в человеческих заболеваниях 21 .

    Как и в предыдущих отчетах, мы обнаружили несколько вариантов кодирования в 5% случаев, которые, как сообщалось, вносили вклад в более тяжелый фенотип 79 . В нашей когорте мы также смогли обнаружить совместную встречаемость не только кодирующих SNV, но и CNV. Два пациента с ГКМП, один с патогенным MYBPC3 SNV и MYOM1 CNV умерли, а другой с вариантом сайта сплайсинга LoF в FLNC и делецией CNV в CTNNA3 потребовалась трансплантация сердца в течение первого года жизни. .Особенно любопытным открытием нашего исследования было то, что до 14% случаев имели несколько вариантов регуляции высокого риска, иногда в сочетании с вариантом патогенного кодирования. Все эти варианты были обнаружены в генах, важных в структуре миоцитов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы изучить связь нескольких вариантов регуляции с тяжестью заболевания.

    Роль регуляторных вариантов могла быть недооценена в нашем исследовании, так как мы не изучали дистальные энхансеры. Кроме того, TFBS, которые не похожи на согласованную последовательность, могли быть ошибочно классифицированы как не относящиеся к группе высокого риска.Поскольку прогнозы in silico со временем улучшаются, это позволит более широко изучить регулом для вариантов заболевания. Наконец, мы были ограничены в нашей способности оценивать экспрессию эндогенных генов из-за небольшого количества доступных образцов миокарда.

    В целом, наши выводы о том, что варианты с высокой степенью достоверности, идентифицированные с использованием моделей прогнозирования in silico , имеют функциональные последствия, подтверждают наш биоинформатический подход к открытию новых вариантов и дают веские основания для изучения вариантов в рекуррентно мутировавших цис-регуляторных элементах генов CMP с целью увеличить результативность генетического тестирования 80,81 .Таким образом, наша работа обеспечивает руководящую стратегию для решения регуляторных вариантов сердечных заболеваний и подчеркивает необходимость дальнейших исследований для подтверждения клинической применимости этих результатов.

    МЕТОДЫ

    Когорта исследования

    Когорта исследования включала несвязанные первичные пациенты с индексом CMP в возрасте до 21 года на момент постановки диагноза, а также затронутых и незатронутых членов семьи, набранных в период с 2007 по 2018 год через Биобанк кардиологического центра при Больнице для больных детей, Торонто 80 .HCM, DCM, RCM, LVNC и AVC были диагностированы на основании опубликованных клинических критериев 82,83 . Были исключены пациенты со вторичными БКМ, возникшими в результате врожденных нарушений метаболизма, митохондриальных нарушений, синдромной и нервно-мышечной этиологии. Были собраны клинические данные, включая демографические данные, диагноз, семейный анамнез, результаты клинического генетического тестирования и исходы во время последующего наблюдения. Средний возраст на момент постановки диагноза составлял 2,8 года (диапазон 0-20), 42% составляли женщины. Основными этническими группами, о которых сообщают сами респонденты, были 71% белых, 17% азиатов, 6% чернокожих.26% случаев были генотип-положительными при предыдущем клиническом панельном тестировании, 47% были генотип-отрицательными и 27% клинически не тестировались. Десять пациентов (4,7%) умерли, и 130 пациентов (57%) испытали серьезное неблагоприятное сердечно-сосудистое событие при последующем наблюдении ( Дополнительная таблица 1 ). Сбор и использование ДНК человека и ткани миокарда от пациентов с CMP через Реестр биобанков кардиологического центра было одобрено Советом по этике институциональных исследований (Больница для больных детей, Детская больница Восточного Онтарио, Общая больница Торонто, Лондонский центр медицинских наук, Кингстонская больница общего профиля , и Hamilton Health Sciences Center), и письменное информированное согласие было получено от всех пациентов и / или их родителей / законных опекунов 80,81 .

    Секвенирование всего генома (WGS)

    WGS было выполнено на высококачественной ДНК из крови или слюны для достижения минимального 30-кратного покрытия с использованием платформы Illumina HiSeq X через Macrogen, Южная Корея, и Центр прикладной геномики (TCAG, Больница для больных детей, Торонто). Высококачественные считывания с парных концов (2 × 150 п.н.) были сопоставлены с эталонной последовательностью генома человека (hg19) с использованием выравнивателя Isaac, и варианты были вызваны с использованием вызывающего варианта Isaac варианта 84 . Метрики качества WGS были рассчитаны с использованием mosdepth (https: // github.com / brentp / mosdepth) 85 . Образцы со средним охватом всего генома менее 10X были исключены из дальнейшего анализа. Варианты, передающие стандартные метрики качества вызывающего варианта Isaac, были аннотированы с помощью snpEff (v.4.3) 86 и annovar (v.2016.02.01) 87 . Варианты, используемые для последующего анализа, дополнительно должны были иметь флаг «PASS» в поле «FILTER». SNV дополнительно требовалось, чтобы общая глубина отфильтрованного чтения (‘DP’) ≥ 10X, в то время как indel дополнительно требовалось, чтобы общая отфильтрованная глубина считывания в позиции, предшествующей indel (‘DPI’) ≥ 10X.Общее количество SNV на выборку было рассчитано с помощью bcftools 88 .

    Варианты кодирования белков в генах CMP

    Путем анализа данных из базы данных Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), различных коммерчески доступных панелей генов CMP, ручного отбора из литературы, мы составили первичный список из 133 генов-кандидатов с сильной ассоциацией с CMP ( Дополнительная таблица 2 ). Митохондриальные гены были исключены. Мы разработали вычислительные рабочие процессы для интерпретации SNV (missense, splicing, LoF), indels и CNV в областях кодирования и некодирования.

    SNV, кодирующие белки, и индели

    Мы разработали рабочий процесс индивидуальной классификации вариантов для идентификации кодирующих патогенные белки и SNV сайтов сплайсинга на основе руководящих принципов ACMG 2015 24 . Система автоматической классификации вариантов была основана на информации из различных источников, включая ClinVar 89 и базу данных мутаций генов человека (HGMD) 90 , чтобы определить патогенные или вероятные патогенные варианты, о которых ранее сообщалось. 1000 геномов 91 , NHLBI-ESP 92 , Exome Aggregation Consortium (ExAC) и база данных агрегации генома (gnomAD) были использованы в качестве контрольных образцов для фильтрации редких вариантов, определенных как MAF <0.01% 93 . Патогенность миссенс-вариантов была предсказана с использованием оценок прогноза по крайней мере из пяти инструментов прогнозирования, включая SIFT 94 , PolyPhen2 95 , MutationTaster2 96 , Mutation Assessor 97 , CADD 27 , PROVEAN 25 значение из пакета PHAST для множественного выравнивания 99 геномов позвоночных с геномом человека (phyloP100way_vertebrate) 98 , MetaSVM и MetaLR 26 . Оценка сохранности генома была получена из GERP ++ 99 и phastCons 12 .Предполагаемые варианты усечения белков, которые, по прогнозам, вызывают потерю функции, включая варианты сайта сплайсинга, бессмысленные варианты и варианты со сдвигом рамки, были оценены и аннотированы с помощью инструмента LOFTEE (https://github.com/konradjk/loftee) в качестве подключаемого модуля через Ensembl Variant Effect Predictor (VEP v90) инструмент 100 . Патогенность вариантов, выявленных в ходе клинических испытаний, была подтверждена с использованием классификаций ClinVar 89 и InterVar 101 , где это возможно. Сегрегация и анализ de novo были выполнены для всех вариантов, когда WGS из членов семьи был доступен.SNV и индели в генах CMP, которые соответствовали критериям патогенности, описанным выше, и которые, кроме того, имели MAF <0,01% в эталонной популяции gnomAD v2.1.1, считались причинными для CMP. Эти вероятные причинные варианты были рассмотрены и подтверждены посредством независимой классификации институциональной лабораторией молекулярно-генетического тестирования, и все зарегистрированные SNV были подтверждены с использованием секвенирования по Сэнгеру, где это возможно.

    CNV, кодирующие белки

    Для вызова CNV используются два алгоритма на основе глубины чтения, ERDS v1.1 (оценка по глубине чтения с SNV) 102 и CNVnator v0.3.2 103 , использовались, как описано ранее 29 . Выявленные области CNV были аннотированы с помощью специального конвейера аннотаций, разработанного в TCAG. Чтобы повысить достоверность звонков, в последующий анализ были включены только области CNV размером> 1kb с как минимум 50% взаимным перекрытием между вызовами ERDS и CNVnator и <70% перекрытием с теломерами, центромерами и сегментарными дупликациями. Редкие CNV были определены как варианты, встречающиеся с частотой <1% в более чем 1500 контрольных образцах родительских образцов из когорты аутистов, MSSNG 18 .Используя карту CNV генома человека 30 , события CNV, перекрывающие области CNV, которые были подвержены количеству копий <30%, были приоритетными для последующих анализов. Редкие CNV размером> 1 КБ, влияющие на кодирующие экзоны, были проверены вручную с использованием чтения из файлов BAM и дополнительно проверены с помощью qPCR со 100% соответствием. Пациенты, у которых не было хотя бы одного причинного варианта (т.е. редкий, кодирующий белок патогенный SNV или CNV в генах CMP), считались неуловимыми для генов, и их дополнительно оценивали на предмет кодирующих белки вариантов в новых генах и в регуляторных элементах известных CMP. гены.

    Анализ вариантов De novo

    Полные трио родитель-потомок были доступны в 22 случаях. Чтобы идентифицировать варианты de novo, мы создали полный набор инструментов анализа генома (GATK) / v4.1.2.0 передовой опыт 104 локально для совместного вызова коротких вариантов (SNV и indels) в нашей когорте. Необработанные считывания с парных концов были сначала обрезаны и очищены с помощью trimmomatic v.0.32, затем сопоставлены с эталонным геномом человека GRCh47 для каждого образца с помощью bwa v.0.7.15. Эталонная последовательность генома и обучающий набор данных были загружены с сайта пакета GATK (ftp.broadinstitute.org/bundle/b37). Сопоставленные показания были повторно согласованы и откалиброваны с помощью инструментов перекалибровки базовой оценки качества (BQSR). HaplotypeCaller использовался для создания файлов генотипа VCF (gVCF) для каждого образца. Наконец, файлы gVCF для всех образцов были объединены и вызваны совместно с помощью инструментов CombineGVCFs и GenotypeGVCFs. Чтобы отфильтровать вероятные артефакты в вызовах, SNP и инделки были повторно откалиброваны отдельно инструментами Variant Quality Score Recalibration (VQSR) и вариантами, которые прошли уровень достоверности VQSR 99.5 для SNP и 99.0 для инделей. Мы развернули рабочий процесс уточнения GATK, чтобы идентифицировать варианты de novo, которые были признаны патогенными или вероятными патогенными в соответствии с критериями ACMG. Чтобы сделать вывод о возможных сайтах de novo с высокой степенью достоверности, мы сначала пересчитали вероятности генотипов образцов в масштабе phred, введя набор вызовов проекта «1000 геномов» (1000G_phase3_v4_20130502) и родословные троек. Эти дополнительные данные могут использоваться в качестве предварительных данных для повторной калибровки достоверности генотипов, а не только для расчета вероятности генотипа образца только по его считыванию.На этом этапе был применен инструмент CalculateGenotypePosteriors. Затем мы использовали VariantFiltration, чтобы выделить сайты с низким качеством генотипа (GQ), значения GQ которых были ниже 20, а глубина считывания была ниже 10. Наконец, только сайты со всеми номерами трио ≥ GQ 20 были определены как сайты с высоким уровнем достоверности de novo. варианты в окончательном наборе вызовов.

    Кодирующие белки варианты LoF в новых генах CMP

    Чтобы идентифицировать новые предполагаемые гены CMP помимо 133 установленных генов CMP, мы провели поиск предполагаемых вредных гетерозиготных и гомозиготных вариантов LoF (т.е.е. варианты со сдвигом рамки считывания, бессмыслица, временная задержка, стоп-лосс и сплайсинг) в остальной части экзома среди случаев CMP, которые действительно несли патогенный кодирующий белок или регуляторный вариант высокого риска в гене CMP. Варианты LoF были идентифицированы с использованием LOFTEE (https://github.com/konradjk/loftee) 32,33 . Все варианты LoF должны были быть предсказаны как высокоэффективные с помощью VEP 100 , наблюдаемые при частоте аллелей <0,01% в эталонной популяции gnomAD, наблюдаемые в <1% неродственных семей в когорте и влияющие на гены, которые экспрессируются в человеческое сердце.Варианты дополнительно определялись по приоритету, если они принадлежали к сильно ограниченному гену (gnomAD pLI> 0,9) и / или были важны для функции сердца. Категории уровней экспрессии генов в тканях были получены из Атласа белков человека (http://www.proteinatlas.org) 35 .

    SNV и CNV в регуляторных элементах генов CMP

    Была создана карта регуляторных областей генома человека, в первую очередь промоторов, проксимальных и дистальных энхансеров, активных в развивающемся сердце и сердце взрослого человека, на основании экспериментальных данных и данных Проект энциклопедии элементов ДНК (ENCODE) 47 , проект FANTOM 46 , эпигеномика дорожной карты 49 и опубликованные данные Дикеля и др. 48 .Промоторные области всех генов CMP, не включенных Dickel et al, были определены как 1,5 т.п.н. выше и 1,25 т.п.н. от сайта начала транскрипции (TSS). TSS для канонических транскриптов и, при необходимости, сердечных транскриптов в сборке 37 генома человека (hg19) были загружены из Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org — по состоянию на октябрь 2017 г.). Чтобы идентифицировать SNV риска в определенных регуляторных областях генов CMP, был разработан и реализован автоматизированный конвейер приоритизации вариантов без кодирования.Вкратце, варианты в определенных регуляторных областях аннотировали с использованием Ensembl’s Variant Effect Predictor (VEP v90) 100 . Варианты, частично совпадающие с известными регуляторными характеристиками Ensembl, сравнивали с вариантами, выявленными в данных WGS в контрольных популяциях в gnomAD (n = 141 456). Регуляторные регионы перечислены в дополнительной таблице 9 . Функциональное влияние редких регуляторных вариантов оценивалось на основе баллов создания или разрушения TFBS. Баллы для разрушения TFBS (потеря мотива) и создания TFBS (усиления мотива) были основаны на комбинированных оценках прогнозов из четырех различных инструментов — RegulomeDB 50 , motifbreakR 51 , DeepSEA 52 и Fathmm-MKL 105 .Варианты считались Уровнем 1 и оценивались как разрушающие по крайней мере 3 из 4 инструментов прогнозирования (Уровень 1). Регуляторные варианты были дополнительно расставлены по приоритету, если они встречались в неуловимых генах случаев CMP, были связаны с геном, имеющим OR> 1,3 по сравнению с контрольной когортой ICGC, и находились в области, которая активна в LV человека. Межгенные и интронные CNV, а также перекрывающиеся промоторы indels <1kb и энхансеры, активные в развивающемся и взрослом сердце человека, как определено Dickel et al. 48 , также были приоритетными.

    Анализ бремени регуляторных вариантов «случай-контроль»

    Вызов вариантов WGS было получено от 1326 пациентов без сердечных заболеваний, включенных в Международный консорциум генома рака (ICGC) 54 . Образцы WGS были получены из нормальной ткани, 998 из которых состояли из крови, 224 из твердых тканей из участка, удаленного от первичной опухоли, 76 прилегающих твердых тканей и 28 других тканей. Пациенты включали 579 женщин и 747 мужчин; диагнозы включали 286 рака поджелудочной железы, 221 рак мозга, 178 рака простаты, 123 рака груди, 98 рака пищевода, 82 рака печени, 74 рака почек, 70 рака кожи, 68 рака яичников, 64 рака костей, 37 рака желудка, 13 рака полости рта, и 12 видов рака желчных путей.Данные были получены из раздела Панорамного анализа целых геномов портала данных ICGC (PCAWG). Образцы были сопоставлены с hs37d5 (GRCh47), и вызовы вариантов зародышевой линии были сделаны с использованием конвейера вызова вариантов DKFZ / EMBL. «НОРМАЛЬНЫЕ» выборочные вызовы были извлечены и отфильтрованы аналогично когорте обнаружения: для последующего анализа использовались только варианты с флагом «PASS», охваченные как минимум 10 чтениями (DP / DPI ≥10). Вызовы вариантов были преобразованы в hg19 с помощью Picard LiftoverVcf (http: // broadinstitute.github.io/picard/).

    Чтобы сравнить бремя вариантов между случаями и контролями для вариантов уровня 1 в регуляторных элементах генов CMP, требовалось, чтобы вызовы вариантов имели частоту аллелей ≤0,01% в gnomAD. Варианты, наблюдаемые в ≥1% образцов в исследуемой когорте, были исключены из нагрузочного тестирования, чтобы уменьшить количество ложноположительных вариантов. Для каждого сравнения (ген, путь или весь регулом) OR были рассчитаны как частота случаев по сравнению с контролями, содержащими хотя бы один вариант.P-значения были рассчитаны с использованием двустороннего точного критерия Фишера. Пороговое значение коэффициента ложного обнаружения (FDR) 0,2 было применено после удаления тестов, в которых не наблюдались варианты в комбинированном случае и контрольной выборке. Чтобы уменьшить смещение в этих расчетах и ​​избежать «нулевых ячеек» в таблицах непредвиденных обстоятельств, к каждой наблюдаемой частоте было добавлено 0,5 (поправка Холдейна-Анскомба). Все статистические анализы были выполнены с использованием статистического программного обеспечения R версии 3.5.1.

    Когортный анализ репликации

    Анализ бремени регуляторных вариантов был расширен до независимой когорты из 1266 случаев CMP с использованием образцов из проекта 100000 Genomes Project, доступных нам через Genomics England Clinical Interpretation Partnership из версии 8 основной программы 94

    85, MyBiosource, Сан-Диего, Калифорния, США) или поликлональное антитело NRAP (PAS-88772; Invitrogen, Калифорния, Карлсбад, Калифорния , США) в блокирующем буфере в течение 2 часов при комнатной температуре ( Дополнительная таблица 12 ).Контрольный ген GAPDH (ab8245, abcam, Кембридж, Великобритания) использовали в качестве контроля загрузки. После обширной промывки мембраны PBS / Tween-20 в качестве вторичных антител использовали козий анти-кроличий IgG-HRP и козий антимышиный IgG-HRP (Invitrogen, Carlsbad, California) в качестве вторичных антител в разведении 1: 2000 для 1 ч при комнатной температуре. Реактивные полосы визуализировали с помощью системы визуализации ChemiDoc MP (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США). Экспрессию белка в миокарде ЛЖ пациента, несущего этот вариант, сравнивали с контрольными образцами других пациентов с ХМП, у которых этот вариант не был.Результаты были количественно оценены с использованием программного обеспечения ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ), и относительное содержание белка в сигнале иммуноблоттинга от каждого целевого белка было нормализовано к среднему количеству сигнала иммуноблоттинга контрольных образцов. Статистический анализ проводился с использованием непарного критерия Стьюдента по данным 2 независимых экспериментов. Статистически значимыми считали различия при p <0,05.

    Иммуногистохимия (IHC)

    Фиксированная формалином и парафиновая заделка (FFPE) ткань LV от пациента с CMP с вариантом промотора LARGE1 и контроля без LARGE1 вариантов были использованы для анализа IHC с использованием стандартных методов 116 .Блоки ткани FFPE были разрезаны на 4 мкм, депарафинированы в ксилоле, обезвожены с помощью серийных разведений раствора этанола и промыты PBS. Извлечение антигена проводили в растворе для извлечения мишени (Dako, Burlington, ON, Canada) в течение 45 минут с последующим блокированием тканей 3% пероксидазой водорода (H 2 O 2 ) в течение 10 минут. После промывания PBS срезы тканей инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с первичным антителом против LARGE1 (PA5-78393, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) с последующей инкубацией срезов с биотинилированным вторичным антителом в течение еще 30 мин ( Дополнительная таблица 12) .Иммуномечение выявляли с помощью наборов EnVision + System-HRP DAB (Dako, Burlington, ON, Canada). Срезы были исследованы и отображены с помощью светового микроскопа. Ядра клеток контрастировали с помощью гистологического окрашивающего реагента Myer’s Hematoxylin (Dako, Burlington, ON, Canada). Фотографии были проанализированы с помощью программного обеспечения для автоматического анализа изображений (Image J, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд). Количество LARGE1-положительных клеток усредняли в 10 полях на срез и повторяли в 3-х повторах.Окрашивание сравнивали между индивидуумом, несущим вариант LARGE1 , и контролями. Непарный t-критерий Стьюдента использовался для определения различий между группами. Значение p <0,05 считалось значимым.

    Репортерные анализы кардиомиоцитов, полученных из ИПСК человека

    Генерация кардиомиоцитов ИПСК человека

    Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из лимфоцитов периферической крови здорового взрослого донора (PGP17), были дифференцированы в кардиомиоциты (CM) Набор для дифференциации кардиомиоцитов STEMdiff.Линия ИПСК PGP17_11 лишена каких-либо известных вариантов сердечных заболеваний, и протокол дифференцировки в кардиомиоциты был ранее описан 114 . Биение дифференцированных кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, наблюдалось на 8-й день после дифференцировки. Клетки повторно высевали на 16 день в 12-луночные планшеты для временной трансфекции. Кардиомиоциты котрансфицировали люциферазными конструкциями на 21 день. Трансфицированные клетки собирали через 48 часов после трансфекции, и активность люциферазы светлячка и рениллы измеряли с использованием системы анализа Dual-Luciferase® Reporter.

    Анализ репортерной люциферазы

    Для функциональной проверки влияния вариантов на транскрипцию гена использовали систему репортерного анализа Dual-Luciferase® (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) для тестирования и сравнения транскрипционной активности репортерного гена люциферазы под действием эффекта. вариантного промотора или энхансера + промоторная последовательность от пациента, или эталонной последовательности генома каждой регуляторной области в качестве контроля дикого типа 67,68 . Для создания люциферазных плазмид, несущих последовательность регуляторного элемента предсказанных вариантов и дикого типа в качестве контроля, нуклеотидные последовательности 1.Были коммерчески синтезированы 5-килобайтные промоторные области BRAF, DSP, DTNA, FKRP, FKTN и LARGE1 , а также 2-килобайтные энхансерные / промоторные области TGFB3 , содержащие наиболее сильную область транскрипционной активации ( Дополнительная таблица 13 ) (Synbio Technologies, Monmouth Junction, NJ, USA). Коммерческие плазмиды, кодирующие соответствующие последовательности дикого типа, энхансера или варианта промотора, расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами и клонировали отдельно во множественные сайты клонирования основных векторов люциферазы Firefly (pGL4.10-люк2; Промега, Мэдисон, Висконсин, США). Кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека, высевали в 12-луночные планшеты и котрансфицировали 2 мкг векторов люциферазы светлячков (pGL4.10-luc2; Promega, Мэдисон, Висконсин, США), несущих регуляторные последовательности дикого типа, BRAF, DSP, Варианты DTNA, FKRP, FKTN и LARGE1 или TGFB3 и 40 нг репортерных векторов контроля люциферазы Renilla (вектор pRL-TK; Promega, Мэдисон, Висконсин, США) для нормализации условий трансфекции.Через 48 ч после трансфекции люминесценцию детектировали с помощью системы анализа Dual-Luciferase® Reporter (DLR ™). Эксперимент проводили в трех независимых повторах, и каждый образец также тестировали в трех повторах в каждом эксперименте. В той же лунке измеряли люциферазу светлячка, а затем люциферазу Renilla. Нормализующую активность экспериментального репортера рассчитывали путем деления сигнала люциферазы светлячка на сигнал внутренней люциферазы рениллы. Управляемый промотором контрольный вектор люциферазы светлячка (pGL4.13-люк2 / SV40; Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Непарный двусторонний t-критерий Стьюдента использовали для сравнения, есть ли разница между люциферазной активностью репортерного гена люциферазы под действием регуляторной вариантной последовательности и эталонной последовательностью каждой регуляторной области в качестве контроля дикого типа. Порог значимости был установлен на уровне p <0,05.

    Массивно-параллельный репортерный анализ (MPRA)

    Олигонуклеотиды длиной 135 п.н. со штрих-кодами из 11 п.н. были разработаны и синтезированы TwistBioscience (США).Варианты были сосредоточены в пределах олигонуклеотида 135 п.н. Полный список протестированных вариантов можно найти в дополнительной таблице 6 . Для контроля технических вариаций и оценки биологической значимости каждый протестированный аллель был представлен как минимум 25 раз, каждый с уникальным штрих-кодом. Библиотека олигонуклеотидов содержала 2700 олигонуклеотидов для наших геномных вариантов, 100 олигонуклеотидов для положительных контролей и 1500 олигонуклеотидов для отрицательных контролей, то есть скремблированных последовательностей. Эти олигонуклеотиды были частью библиотеки олигонуклеотидов, которая включала дополнительные 234 500 последовательностей в рамках более крупного исследования.Стратегию клонирования библиотеки олигонуклеотидов и отбор положительных отрицательных контролей (300 случайных последовательностей, каждая с 5 штрих-кодами) выполняли согласно Mattioli et. al 23 . Библиотеку олигонуклеотидов трансфицировали в пять биологических повторений кардиомиоцитов, полученных из ИПСК PGP17, с эффективностью трансфекции более 80% во всех повторностях, используя реагент для трансфекции ствола липофектамина (STEM00015 Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) (, дополнительная фигура 3b, ).Через 48 часов после трансфекции собирали тотальную РНК и удаляли загрязнения ДНК с использованием ДНКазы I (18047019, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA). Образцы РНК с числом целостности РНК> 7 использовали для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы SuperScript IV (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). кДНК использовали для синтеза библиотеки, если в ней отсутствовала контаминация плазмид, как определено с помощью qRT-PCR, выполненной в системе qPCR ViiA7 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) с использованием PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США) ( Дополнительный рисунок 3c ).Библиотеки Tag-seq получали, как описано ранее 23 , и секвенировали с односторонним считыванием 50 п.н. на платформе HiSeq2500 (TCAG, Госпиталь для больных детей, Торонто). Данные анализировали с использованием программного обеспечения MPRAAnalyze 23,117 , используя случайные олигонуклеотидные последовательности в качестве нулевого распределения. Значения P были рассчитаны с использованием теста отношения правдоподобия с MPRAAnalyze, и значение FDR <0,05 считалось значимым.

    Редактирование CRISPR-Cas9 для оценки функции нового гена в эмбрионах рыбок данио

    Все исследования эмбрионов рыбок данио были выполнены в Центре генетики и моделей заболеваний SickKids (ядро рыбок данио), Торонто, и одобрены Комитетом по уходу за животными SickKids (Протокол № 401951) .

    Дизайн, синтез и микроинъекция направляющей РНК (gRNA)

    Все последовательности gRNA были адаптированы из 45 и описаны в Supplementary Table 14 . Последовательности праймеров ( Дополнительная таблица 15 ) были синтезированы с помощью Integrated DNA technologies (IDT, Coralville, Iowa, USA) и использованы для синтеза sgRNA in vitro в соответствии с ранее описанным протоколом 45 . Микроинъекции выполняли, как описано ранее 45 с небольшими изменениями.Вкратце, для nrap гРНК1, 250 пг каждой гРНК с 800 пг белка Cas9 (нуклеаза V3 Alt-R ® Sp Cas9, номер по каталогу 1081058, IDT, Коралвилл, Айова, США) совместно вводили в клетки дикого типа. эмбрионы на одной клеточной стадии. Для совместной инъекции 8 гРНК fhod3a + b , gRNA1-gRNA4 вводили 125 пг каждой гРНК, при этом количество белка Cas9 оставалось неизменным. Введенные эмбрионы содержались в 0,003% растворе фенилтиомочевины (PTU) и инкубировались в темном инкубаторе при 28,5 ° C в течение 3 дней.Весь фенотипический анализ, визуализация, выделение ДНК и секвенирование были выполнены через 3 дня после оплодотворения (dpf).

    Экстракция ДНК, ПЦР и анализ последовательности

    Неочищенную ДНК экстрагировали из целых личинок рыбок данио с использованием буфера 1X-PCR (10 мМ KCl, 10 мМ Tris, PH 8,0; 1,5 мМ MgCl2), содержащего 1 мг / мл протеиназы K (Thermo Scientific , Уолтем, Массачусетс, США). Смесь инкубировали при 55 ° C в течение 50 минут, а затем при 98 ° C в течение 10 минут для деактивации протеиназы K. Для секвенирования каждой области гРНК проводили ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Taq (Bio basic, Markham, ON, Канада).25 мкл реакционной смеси содержали буфер для реакции 1X-PCR, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мМ каждого прямого и обратного праймеров, 0,75 ед. Полимеразы Taq и 1,5 мкл неочищенной ДНК (~ 200 нг). Пары праймеров и соответствующие им температуры отжига приведены в дополнительной таблице № 15 . Реакции ПЦР были установлены следующим образом: 95 ° C в течение 5 минут, затем 35 циклов при 95 ° C в течение 20 секунд, температура отжига в течение 1 минуты, 72 ° C в течение 1 минуты и конечная элонгация 72 ° C в течение 5 минут. . Продукт ПЦР очищали с помощью ExoSAP-IT (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя, и 100 нг каждого продукта ПЦР отправляли для секвенирования в TCAG (Торонто, Онтарио, Канада) с праймерами для секвенирования, описанными в . Дополнительная таблица 15 .Результаты секвенирования анализировали с помощью ICE Analysis (https://ice.synthego.com/#/) или Geneious 9.1.4.

    qRT-PCR

    При 3 dpf объединенные образцы РНК собирали либо от личинок рыбок данио, которым инъецировали гРНК целевых генов, либо только Cas9 в качестве контроля с использованием реагента TRIzol ™ (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). КДНК первой цепи синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) в соответствии с инструкциями производителя.Праймеры, перечисленные в дополнительной таблице 16 , использовали для амплификации двух эталонных генов β –актин и GAPDH для нормализации данных. Анализ qRT-PCR проводили в приборе Roche LightCycler 96 с использованием смеси PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Относительный уровень экспрессии рассчитывали на основе двух технических повторов с использованием метода 2 -ΔΔCT 113 .

    Секвенирование

    образцов ДНК были выделены из целых личинок рыбок данио при 3 dpf и отправлены на секвенирование по Сэнгеру в TCAG (Торонто, Онтарио, Канада) для подтверждения эффективности разрезания экзонов, нацеленных на nrap, fhod3a и fhod3b gRNA. по сравнению с Cas9 только в качестве контроля.Инструмент анализа ICE CRISPR (Synthego, Menlo Park, CA) использовался для анализа изменений CRISPR в fhod3b .

    Сердечное фенотипирование рыбок данио

    Сердечное фенотипирование эмбрионов рыбок данио было выполнено при 3 dpf для оценки морфологии, размера и функции сердечной камеры. Для получения изображений с помощью микроскопа in vivo , 3 личинки рыбок данио dpf анестезировали 0,02% трикаином и помещали в 3% метилцеллюлозу в чашки со стеклянным дном 50 мм. Видеоизображение было выполнено с помощью микроскопа Zeiss AXIO Zoom V16 с использованием PlanNeoFluar Z 1X / 0.Объектив 25 FWD 56 мм с увеличением 112x. Была использована функция Movie Recorder в программе Zen pro, и для каждого видео было снято примерно 100 кадров. Все видео были экспортированы со скоростью 17 кадров в секунду для дальнейшего анализа. Изображения были получены с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ti в системе конфокальной визуализации Nikon A1 plus с использованием программы NIS-Elements. Площадь предсердий измеряли в конце систолы, а площадь желудочков измеряли в конце систолы и в конце диастолы с фракцией выброса желудочков, определяемой как (конечная диастолическая площадь — систолическая площадь желудочков) / конечная систолическая площадь желудочков x 100 с использованием ImageJ (). https: // imagej.nih.gov/ij/ ). Размеры предсердий и желудочков и фракция выброса желудочков сравнивали с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента для измерения значимых различий между мутантами ( nrap и fhod3 ) и контролями (Cas9 и дикого типа). Различия считали статистически значимыми при P <0,05.

    Доступность данных

    Данные секвенирования в настоящее время хранятся в Европейском архиве генома-фенома EGA и будут доступны для загрузки после утверждения Комитетом по доступу к данным.Дополнительные данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в файлы дополнительной информации, а дополнительные необработанные данные, используемые для рисунков и результатов, доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу. Все вычислительные инструменты, использованные в этом исследовании, доступны как коммерческое программное обеспечение или программное обеспечение с открытым исходным кодом.

    Доступность данных

    Данные секвенирования в настоящее время хранятся в Европейском архиве генома-фенома EGA и будут доступны для загрузки после утверждения Комитетом по доступу к данным.Дополнительные данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в файлы дополнительной информации, а дополнительные необработанные данные, используемые для рисунков и результатов, доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу. Все вычислительные инструменты, использованные в этом исследовании, доступны как коммерческое программное обеспечение или программное обеспечение с открытым исходным кодом.

    ФИНАНСИРОВАНИЕ

    Эта работа финансировалась Центром исследований сердца Теда Роджерса (SM и JE). SM владеет канадским фондом сердца и инсульта / кафедрой свободы Роберта М. в области сердечно-сосудистых исследований.SWS является заведующим кафедрой геномных наук GlaxoSmithKline в Больнице для больных детей и Университете Торонто. PGM занимает должность канадского кафедры исследований 2 уровня по некодирующим механизмам заболеваний. PGM выражает признательность за поддержку Правительству Канадского фонда новых границ в исследованиях (NFRF), [NFRFE-2018-01305]. Е.О. является профессором семьи Битове по врожденным порокам сердца у взрослых. MM имеет грант Ramon y Cajal от Министерства науки и инноваций Испании (RYC-2017-22249). WO поддерживается фондом Fundació La Marató (321 / C / 2019).JB финансируется стипендией Франса Ван де Верфа для клинических исследований сердечно-сосудистой системы и стипендией старшего клинического исследователя FWO Flanders. К.М. был научным сотрудником Национального научного фонда по гранту № DGE1144152 на протяжении большей части проекта. Проект «100 000 геномов» управляется Genomics England Limited (полностью принадлежащая Министерству здравоохранения и социальной защиты компания). Проект «100 000 геномов» финансируется Национальным институтом исследований в области здравоохранения и Национальной службой здравоохранения Англии.Wellcome Trust, Cancer Research UK и Совет медицинских исследований также финансировали исследовательскую инфраструктуру.

    CONSORTIA

    Исследовательский консорциум Genomics England

    Ambrose, J. C. 1 ; Arumugam, P. 1 ; Baple, E. L. 1 ; Bleda, M. 1 ; Boardman-Pretty, F. 1,2 ; Boissiere, J. M. 1 ; Boustred, C.R. 1 ; Brittain, H. 1 ; Caulfield, M. J. 1,2 ; Chan, G.C. 1 ; Крейг, К.E. H. 1 ; Daugherty, L.C. 1 ; de Burca, A. 1 ; Devereau, A. 1 ; Elgar, G. 1,2 ; Foulger, R.E. 1 ; Fowler, T 1 .; Furió-Tarí, P. 1 ; Giess A. 1 ; Hackett, J. M. 1 ; Halai, D. 1 ; Hamblin, A. 1 ; Henderson, S. 1,2 ; Holman, J. E. 1 ; Hubbard, T. J. P. 1 ; Ibáñez, K. 1,2 ; Jackson, R. 1 ; Джонс, Л.J. 1,2 ; Kasperaviciute, D. 1,2 ; Kayikci, M. 1 ; Kousathanas, A. 1 ; Lahnstein, L. 1 ; Lawson, K. 1 ; Leigh, S.E.A. 1 ; Leong, I.U.S. 1 ; Lopez, F. J. 1 ; Maleady-Crowe, F. 1 ; Mason, J. 1 ; McDonagh, E. M. 1,2 ; Moutsianas, L. 1,2 ; Mueller, M. 1,2 ; Murugaesu, N. 1 ; Need, A.C. 1,2 ; Odhams, C.A. 1 ; Ориоли А. 1 ; Patch, C. 1,2 ; Perez-Gil, D. 1 ; Pereira, M. B. 1 ; Polychronopoulos, D. 1 ; Pullinger, J. 1 ; Rahim, T. 1 ; Rendon, A. 1 ; Riesgo-Ferreiro, P. 1 ; Rogers, T. 1 ; Ryten, M. 1 ; Savage, K. 1 ; Sawant, K. 1 ; Scott, R.H. 1 ; Siddiq, A. 1 ; Sieghart, A. 1 ; Smedley, D. 1,2 ; Smith, K. R. 1,2 ; Смит, С.C. 1 ; Сосинского, А. 1,2 ; Spooner, W. 1 ; Stevens, H.E. 1 ; Stuckey, A. 1 ; Sultana, R. 1 ; Tanguy M. 1 ; Thomas, E. R.A. 1,2 ; Thompson, S.R. 1 ; Tregidgo, C. 1 ; Tucci, A. 1,2 ; Walsh, E. 1 ; Watters, S.A. 1 ; Welland, M. J. 1 ; Williams, E. 1 ; Witkowska, K. 1,2 ; Wood, S. M. 1,2 ; Заровецкий, М. 1

    1. Genomics England, London, UK

    2. Исследовательский институт Уильяма Харви, Лондонский университет Королевы Марии, Лондон, EC1M 6BQ, UK.

    ВКЛАД АВТОРА

    RL, AS, JE, SM разработали концепцию и разработали работу; Получены, проанализированы или интерпретированы RL, AS, OA, JB, TL, RY, FM, RRN, AM, QY, GM, MCSY, WWL, BT, GERC, JL, EO, LB, JS, TM, JE, SWS, SM данные; RL, OA, TL, RY, MCSY, WWL, BT выполнили биоинформатический анализ; KM, KD, WO, MM, PGM разработали, выполнили и проанализировали набор данных MPRA; RL, AS, SM составили оригинал рукописи; RL, AS, PGM, JE, SWS, SM существенно изменили его; и все авторы просмотрели и одобрили окончательную рукопись.

    КОНКУРЕНТНЫЕ ИНТЕРЕСЫ

    SWS — научный консультант Научно-консультативного совета по Deep Genomics Population Bio, и его исследовательские патенты, хранящиеся в Больнице для больных детей, лицензированы Lineagen и Athena Diagnostics. Другие авторы не сообщают о конфликте интересов.

    ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЛЕГЕНДЫ ФИГУРЫ

    Дополнительная фигура 1: Результаты секвенирования редактирования генов у рыбок данио . Секвенирование по Сэнгеру отредактированных генами рыбок данио (n = 7) выявило высокое бремя мутаций в экзонах, нацеленных на 4 гРНК для (a) nrap и (b) fhod3ab по сравнению с контролем только Cas9.Панели показывают эталонную последовательность, расположение гРНК, целевой экзон, эффект только Cas9 по сравнению с гРНК CRISPR / Cas9 в эмбрионах рыбок данио. SNV, инделки и большие делеции показаны коричневым и синим цветом. nrap, fhod3a и fhod3b gRNAs вызвали редактирование CRISPR во всех инъецированных эмбрионах и были проанализированы с использованием программного обеспечения Synthego ICE по мере необходимости.

    Ref-seq, эталонная последовательность: гРНК, направляющая РНК; ICE, вывод CRISPR edits

    Дополнительный рисунок 2: Пути, обогащенные кодирующими белками и регуляторными вариантами в общей когорте (n = 228) .( a ) Онтология генов (категория молекулярных функций) и пути Reactome обогащены патогенными вариантами кодирования и сплайсинга белков. ( b ) Пути, обогащенные регуляторными вариантами уровня 1 высокого риска, включая категории, связанные с мышцами, связывание дистрогликана, рецепторы фактора роста фибробластов и пути Ras.

    Дополнительная фигура 3: Прогнозирующее влияние регуляторных вариантов на мотив связывания фактора транскрипции . SeqLogo использовался для прогнозирования нарушения мотива, вызванного вариантами в регуляторных элементах ( a, b ) BRAF , ( c ) DSP , ( d ) DTNA , ( e ) FKRP , ( f, g ) FKTN , ( h, i ) LARGE1 , ( j ) PRKAG2 и ( k ) TGFB3 .Пара нуклеотидных оснований, обведенная красным прямоугольником, указывает положение варианта в мотиве. Анализ регуляторной последовательности вариантов показывает изменение одного нуклеотида в каждом варианте по сравнению с эталонной последовательностью, что приводит к нарушению мотивов факторов транскрипции, которое, как предполагается, связано с повышающей или понижающей регуляцией транскрипции целевого гена.

    Майор, контрольная последовательность; Риск, вариантная последовательность.

    Дополнительный рисунок 4: Люциферазные анализы в CMs, полученных из hiPSC .( a ) Использовали векторы репортерного гена люциферазы, несущие различные промоторные последовательности. Управляемый промотором контрольный вектор люциферазы Firefly (pGL4-13_luc2_SV40) и базовый вектор люциферазы Firefly без промотора (pGL4-10-luc2) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Контрольные репортерные векторы Renilla Luciferase (вектор pRL_TK) использовали для нормализации условий трансфекции. Последовательности регуляторных элементов предсказанных вариантов и вариантов дикого типа были коммерчески синтезированы и клонированы отдельно во множественные сайты клонирования основных векторов люциферазы светлячка, pGL4.10_luc2. CMs, происходящие от hiPSC, котрансфицировали вектором люциферазы светлячка, несущим регуляторные последовательности отдельно, и контрольным репортерным вектором люциферазы Renilla. Люминесценцию детектировали с помощью системы анализа Dual-Luciferase® Reporter (DLR ™). ( b ) Успешная дифференцировка (окрашивание сердечного тропонина Т красным цветом) и трансфекция плазмиды pX601_GFP (зеленый) в кардиомиоциты, полученные из ИПСК PGP17 на 21 день, с использованием реагента для трансфекции ствола липофектамина. Увеличение: × 20. ( c ) qRT-PCR выполняли для обнаружения загрязнения ДНК в результате трансфекции пула плазмид 5 биологических повторов кардиомиоцитов PGP17.( d ) Унимодальное распределение штрих-кодов, которые представляют олигонуклеотиды, используемые в этом проекте. Ввод ДНК представляет собой пул плазмид олигонуклеотидов, в то время как реплики 1-5 (каждая репликация разделена на две дорожки HiSeq2500) проточных клеток представляют собой библиотеки tag-seq, полученные в результате трансфекций кардиомиоцитов. ( e ) Корреляция Пирсона для 5 повторов MPRA. hiPSC, индуцированная человеком плюрипотентная стволовая клетка; CM, кардиомиоциты; GFP, зеленый флуоресцентный белок; Р, плазмида; Пр, промоутер; En, Enhancer; Люк, Люцифераза; RES, последовательность регуляторного элемента, WT, дикий тип; V — вариант; rep, replicate

    ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТАБЛИЦЫ

    Дополнительная таблица 1: Клинические характеристики пробандов детской кардиомиопатии в когорте обнаружения (n = 228).

    Дополнительная таблица 2: Список генов кардиомиопатии.

    Дополнительная таблица 3: Гены кардиомиопатии, несущие патогенные или вероятные патогенные кодирующие SNV и инделы (n = 228 несвязанных случаев).

    Дополнительная таблица 4: вариантов количества копий, влияющих на гены кардиомиопатии (n = 228 несвязанных случаев).

    Дополнительная таблица 5: Варианты потери функции в новых генах кардиомиопатии (n = 228 неродственных случаев).

    Дополнительная таблица 6 : Варианты потери функции в NRAP и FHOD3 в когортах обнаружения кардиомиопатии (n = 228) и репликации (n = 1266).

    Дополнительная таблица 7: SNV высокого риска (и кандидаты) уровня 1 в регуляторных элементах генов кардиомиопатии (n = 228 случаев)

    Дополнительная таблица 8 : SNV уровня 1 в регуляторных элементах генов кардиомиопатии, оцененные MPRA (n = 228 случаев)

    Дополнительная таблица 9: Регуляторные области генов кардиомиопатии для картирования некодирующих вариантов.

    Дополнительная таблица 10: Нормализованные данные RNAseq для генов с CNV высокого риска, LoF и регуляторными вариантами

    Дополнительная таблица 11: пар праймеров для qRT-PCR в миокарде LV генов-кандидатов, несущих регуляторные варианты.

    Дополнительная таблица 12: Антитела, используемые для вестерн-блоттинга и иммуногистохимии

    Дополнительная таблица 13: Синтез последовательностей промотора и энхансера гена для анализов люциферазы.

    Дополнительная таблица 14: Дизайн одиночных направляющих РНК для нацеливания новых генов в эмбрионах рыбок данио.

    Дополнительная таблица 15: пар праймеров для редактирования CRISPR-Cas9 новых генов в эмбрионах рыбок данио.

    Дополнительная таблица 16: пар праймеров для qRT-PCR для новых генов, на которые нацелено редактирование гена CRISPR-Cas9 в эмбрионах рыбок данио.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Мы благодарим семейный кардиологический центр Лабатт Биобанк при больнице для больных детей за доступ к образцам ДНК для полногеномного секвенирования и Центр прикладной геномики при больнице для больных детей за выполнение секвенирования. Мы благодарим Xiucheng Cui и Emanuela Pannia за выполнение экспериментов с рыбками данио в SickKids Zebrafish Genetics and Disease Models Core (синтез CRISPR-Cas9 и gRNA, микроинъекции эмбрионов рыбок данио, валидация gRNA PCR, qRT-PCR, визуализация сердца).

    alexxlab

    Related Posts

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    2021 © Все права защищены.